环介导等温扩增法检测人乳头瘤病毒16、18的应用研究*

河北北方学院附属第一医院(张家口075000) 苏 华 陈 琛 许玉环 李梦嘉



环介导等温扩增法检测人乳头瘤病毒16、18的应用研究*

河北北方学院附属第一医院(张家口075000) 苏 华 陈 琛 许玉环 李梦嘉

目的：环介导等温扩增技术检测人乳头瘤病毒HPV16、18的应用研究。方法：收集宫颈癌行HC-Ⅱ-HPV检测标本高危型的47例，低危型34例。阴性对照20例，分别利用环介导等温扩增(LAMP)方法和PCR方法进行检测，并对检测结果进行比对分析。结果：HC-Ⅱ-HPV筛查的高危组标本中，LAMP检出HPV16 和HPV18的阳性率分别是37%和6%，均高于PCR的31%和4%，在HC-Ⅱ-HPV筛查的低危组标本中，LAMP法和PCR法均有高危型别的检出。LAMP法略优于PCR法，二者比较无统计学差异(P>0.05)。结论：LAMP法在HPV高危型16、18的筛查中与PCR法无差异，然而LAMP法是更经济、便捷的HPV16、18 亚型筛查方法。

在妇科恶性肿瘤中，宫颈癌是仅次于乳腺癌的威胁妇女健康的第二杀手,全球每年大约有 47 万妇女罹患宫颈癌。目前研究认为，宫颈持续感染高危型HPV(HR-HPV)99%以上是宫颈癌发生的必要条件[1]，而其中70%的宫颈癌都是由HPVl6和18型感染引起[2]，因此病毒基因准确分型对判断疾病类型、判断预后、监测治疗复发具有重要的意义，同时在HPV基因型流行状况的地区性调查及基因疫苗的研制上都具有重要的科研价值。公认的HPV检测方法是杂交捕获II代(Hybridcaptureassay-Ⅱ，HC-II)技术，然而该技术最大的缺点是不能具体分型。而PCR灵敏度高，是目前进行HPV基因检测及分型的主要策略，但因其对实验条件要求高而不利于推广应用。环介导等温扩增(Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP)技术是Notomi等2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法。LAMP可以在等温条件下实现扩增，不需要精密实验仪器，具有简便、高效特异性强的特点。研究进行了利用LAMP技术检测人乳头瘤病毒16型和18型的应用研究，为建立快速、特异及敏感检测HPV的方法提供依据。

材料与方法

1 标本来源 收集我院2015年1～12月生殖中心宫颈癌行HC-Ⅱ-HPV检测(试剂盒采用QIAGEN公司的digene检测试剂盒，可检测13种高危型HPV)的标本101例，其中确认为高危型的47例，低危型的34例。同时收集正常体检行宫颈液基薄层细胞检测(TCT)的标本20例作为阴性对照。本实验经伦理观察委员会论证通过。

2 样本前处理 将送检标本充分振荡混匀，15000r/min离心5min，弃上清，留沉淀，加600μl病毒DNA提取液充分混匀，加700μl异丙醇，振荡混匀，12 000r/min离心1min，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤2次，12 000r/min离心1min，弃上清液，将离心管倒置于滤纸上10～15min，待酒精挥发干净后加入100μlTE溶液4℃过夜充分溶解DNA，-20℃保存备用。

3 环介导等温扩增引物 通过GeneBank检索HPV16、18目的基因片段，进行同源性比对，选择HPV16基因组E7外显子和HPV18基因组E6区域设计引物，引物设计采用专业LAMP引物设计软件(PrimerExplorerversion.3)。分别设计HPV-16、18正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)，还可通过设计两条环引物使其反应速度增加1/2-1/3。引物见表1。

表1 HPV16和HPV18LAMP寡核苷酸引物序列

4LAMP检测 以待检标本为模板，反应体系为50μl：3μl20μmol/L引物FIP和BIP，0.6μl20μlmol/L的引物F3和B3，7μl10mmol/LdNTP，8μl5mol/L三甲铵乙内酯(betaine)，5μl10×Buffer，6μl25mmol/LMgSO4，1μlBstDNApolymerase(8U/μl)，DEPC水补充体积到50μl。95℃预变性，5min，65℃反应 60min，80℃2min终止反应。取10μlLAMP反应液于2%琼脂糖凝胶电泳观察。于反应管中加入1.0μl荧光探测试剂(SLP221，荣研生物科技有限公司)，混匀后，65℃30min，在紫外光下观察反应液颜色变化，也可肉眼直接观察其沉淀物。

5PCR反应 以待检标本为模板，以HPV16、18F3、B3引物进行PCR反应，反应体系：10×ReactionBuffer2.5.0μl，HPV16、18DNA模板1μl，dNTP(5mmol/L)1.0μl，F3(10μmol/L)和B3(10μmol/L)各1μl，TaqDNApolymerase(5U/μl)1μl，加DEPC处理水至总体积25μl。反应条件：92℃ 3min； 92℃ 30sec，60℃ 45sec，72℃ 1min35个循环；72℃ 5min；4℃保存。取5μl扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

6 统计学方法 所有实验数据用SPSS17.0统计软件进行分析,离散趋势以百分率表示；率间的比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 成功建立了HPV16和HPV18的LAMP法检测方法 环介导等温扩增反应后，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，观察到明显的阶梯状产物条带如图1，在产物中加入1.0μl荧光探测试剂，在紫外光下可观察到荧光沉淀，也可直接肉眼观察浑浊和沉淀，结果见图2。以HPV16、18F3、B3引物进行PCR反应后，凝胶电泳结果如图3，得到323bp的HPV18核酸片段和454bp的HPV16核酸片段。

图1 1:LAMP法检测HPV16阳性条带;2:LAMP法检测HPV18阳性条带。

图2 A肉眼直接观察反应结果，对比可见阳性反应管；

图3 1:PCR法检测HPV18，得到323bp核酸片段；2:PCR法检测HPV16，得到454bp核酸片段。

2 样本检测结果 在47例杂交捕获高危组(HC-Ⅱ-HPV高危组)中，LAMP法检出HPV16阳性标本17(37)例，HPV18阳性的标本3 (6)例；用PCR法检出HPV16阳性标本15(31)例，HPV18阳性的标本2(4)例。可见LAMP法阳性检出率高于PCR法，但是二者比较无显著性差异(P>0.05)。34例杂交捕获低危组(HC-Ⅱ-HPV低危组)中，LAMP法检出HPV16阳性标本2(6)例，HPV18无阳性检出；PCR法检出HPV16阳性标本1(3)2例，HPV18无阳性检出。说明在HC-Ⅱ-HPV低危组中仍有高危HPV型的检出，LAMP检出率略高于PCR，但二者差异无统计学意义(P>0.05)。

正常对照组中，LAMP法检出1(5)例HPV16阳性标本。

表2 LAMP法和PCR法检测HPV16、18结果[n(%)]

注：c2检验, P>0.05，LAMP与PCR检出率无显著性差异

讨 论

子宫颈癌是严重威胁女性健康的疾病之一，且发病年龄趋于年轻化，在女性生殖系统恶性肿瘤发病率中仅次于乳腺癌，但病死率却居第1位。持续的高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈上皮内瘤变或癌变(CIN3+)的高度相关因素。因此，子宫颈癌的治疗关键是早期诊断。已知宫颈癌的发生、发展与HPV感染密切相关。Zeng等[3]收集了中国人51245例样本，进行了我国HPV基因型分布的研究，研究发现HPV的健康人群感染率为26%，其中21.12%为正高危型HPV，8.37%为低危型HPV，HPV的阳性感染病例80%是单一HPV型别感染，三种最常见的高危HPV类型依次是HPV-52，-16，和-58，HPV18排在第六位，其中HPV16与HPV18宫颈癌高度相关。因此HPV16和HPV18单一基因型别的检测在宫颈癌的鉴别诊断、判断预后、监测治疗复发都具有潜在的重要的意义。

目前，HPV检测方法应用较普遍的是杂交捕获II代(HC-II)技术，该技术对宫颈癌筛查均有较高的的特异性和灵敏度，然而其最大的缺点是不能具体分型。PCR虽然在HPV分型研究中发挥了重要作用，但其高昂的成本使其不利于进行临床标本的大量筛查。LAMP方法是近年来兴起的一种新型快速检测核酸的分子生物学方法，由于LAMP引物的设计针对靶基因的位点比PCR多，其反应特异性显著高于常规PCR， 且不需要精密实验仪器，扩增效率高。

本实验建立了LAMP技术检测HPV16、18的方法，并通过临床标本的检测和PCR方法的比对进行了应用研究。研究结果显示经过HC-Ⅱ-HPV筛查的高危组标本中，LAMP检出HPV16 37%的阳性率和HPV18 6%的阳性率，均高于PCR的31%和4%，说明其在HPV高危型16、18的筛查中优于PCR法，但是由于二者均具有较高的特异性，比较无统计学差异。同时在HC-Ⅱ-HPV筛查的低危组病例中，LAMP法和PCR法均有高危型别的检出，且LAMP法略优于PCR法，说明LAMP法在高危型的筛查中优于HC-Ⅱ法，提示其在单一高危型别筛查中的优势和良好的推广前景。

LAMP判断结果的方法简便快捷，可在反应产物中加入荧光显色剂，在紫外光下观察结果，进行定性判断，也可以通过直接肉眼观察即可以鉴定其阴阳性。可见LAMP法在结果判断方面与常规的PCR方法相比，更为简便迅速、易于操作。Kumvongpin等[4]研制了一种可以连接到单链DNA上的纳米粒子探针(AuNPs)，用于检测HPV16和HPV18，通过纳米粒子颜色变化来判断LAMP产物浊度的变化，从而进行定性分析。LAMP纳米粒子实验显示了更高的灵敏度和实用性。此外该纳米粒子探针稳定性大于1年，LAMP和纳米粒子探针的组合为HPV16和HPV18筛查在地区医院开展提供了更简便快捷且，高度敏感的替代的工具。在LAMP定量实验的研究中Jearanaikoon等[5]研究发现，通过石英晶体微生物传感器(Auartzcrystalmicrobalancebiosensor)，可定量检测HPV16的浓度，进一步确认HPV单基因型感染与疾病的关系，使LAMP的定量检测成为可能。总之，随着LAMP技术的进一步成熟和完善，其必能在病原体基因检测方面发挥重要作用并逐渐应用于临床。

[1]YildirimJ,G,ArabaciZ.InnovationsinHPVVaccinationandRolesofNursesinCervicalCancerPrevention[J].AsianPacJCancerPrey,2014,15(23):10053-10056.

[2] 李 勤,冯艳红,杨永康.宫颈不典型鳞状细胞156例临床分析[J].陕西医学杂志,2012,41(2):165-166.

[3]ZengZ,YangH,LiZ, et al.PrevalenceandGenotypeDistributionofHPVInfectioninChina:Analysisof51,345HPVGenotypingResultsfromChina'sLargestCAPCertifiedLaboratory[J].Cancer,2016 ,7(9):1037-1043.

[4]KumvongpinR,JearanaikoolP,WilailuckanaC, et al.Highsensitivity,loop-mediatedisothermalamplificationcombinedwithcolorimetricgold-nanoparticleprobesforvisualdetectionofhighriskhumanpapillomavirusgenotypes16and18[J].VirolMethods,2016,234(4):90-95.

[5]JearanaikoonP,PrakrankamanantP,LeelayuwatC, et al.Theevaluationofloop-mediatedisothermalamplification-quartzcrystalmicrobalance(LAMP-QCM)biosensorasareal-timemeasurementofHPV16DNA[J].JVirolMethods, 2016 ,229(5):8-11.

(收稿：2016-05-18)

*河北省卫生厅青年基金项目(20120158)

人乳头状瘤病毒16 人乳头状瘤病毒18 多重聚合酶链式反应 @杂交捕获二代技术

R

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7377.2016.12.003

河北省张家口市科技计划项目(12110051D)