呼吸道铜绿假单胞菌感染病灶藻酸盐合成相关基因的表达*

陕西省第二人民医院呼吸内科 (西安 710005) 陈张琴 王 静 许映龙 费春丽 李 瑛 刘小荔 杨 淼



呼吸道铜绿假单胞菌感染病灶藻酸盐合成相关基因的表达*

陕西省第二人民医院呼吸内科 (西安 710005) 陈张琴 王 静 许映龙∆费春丽 李 瑛 刘小荔 杨 淼

目的:获得一种呼吸道铜绿假单胞菌生物膜检测方法，探讨藻酸盐合成相关基因的表达对临床治疗的影响。方法:提取60例呼吸道铜绿假单胞菌感染患者气管内病变组织，实时荧光定量PCR检测藻酸盐合成相关基因algD、algB、algU、mucA的表达，60例患者根据是否耐药分组,分为耐药组(R组)40例，非耐药组(NR组)20例，根据治疗的难易程度，将60例患者分为治疗困难组(D组)38例，治疗容易组(E组)22例。并进行基因algD、algB、algU、mucA的表达与临床抗生素耐药及治疗难易之间的相关性分析。结果:经细菌培养证实的铜绿假单胞菌感染病例60例，呼吸道病变组织均有algD、algB、algU、mucA基因的表达；耐药组(R组)和非耐药组(NR组)对比，algD、algU表达有统计学差异，algB、mucA表达无统计学差异；容易组(E组)和困难组(D组)对比，algD、algU、algB、mucA差异无统计学意义；细菌耐药和治疗难易的相关性分析显示，细菌耐药和临床治疗难易相关。结论：algD与铜绿假单胞菌藻酸盐的合成有着直接的正相关性，可以作为判断是否有黏液型铜绿假单胞菌生长及生物膜形成的依据，而algU与algD的表达有正相关性。

本实验选取细菌培养证实的呼吸道铜绿假单胞菌感染病例，内镜下气管或支气管内取材，行生物膜形成相关基因及调节基因的检测。藻酸盐是铜绿假单胞菌生物膜胞外多聚基质的主要成分之一，algD基因对藻酸盐合成起关键作用，而mucA基因的突变可造成algD的去阻遏表达，使藻酸盐大量生成。algB、algU促进algD表达。报道如下。

材料与方法

1 标 本 选择2013年1月至2015年12月我院部分临床痰液细菌培养证实为铜绿假单胞菌感染病例，男42例，女18例，年龄37～83岁，平均年龄68岁。气管内镜下收集标本，可为肉芽、病变坏死组织或气管内痂皮等，保存液保存。

2 主要实验器材和试剂 7300 Real Time PCR System(美国Applied Biosystems公司);台式高速冷冻离心机Neofuge 15R(Heal Force);Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies 15596-026)。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo #K1622)。FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche 04 913 914 001);引物(Invitrogen Biotechnology Co.LTD);三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司 10006818);异丙醇(国药集团化学试剂有限公司 80109218);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司 10009218)。

3 引物序列 见表1。

表1 引物序列

4 实验步骤 按试剂盒说明书进行操作，步骤如下：①Trizol Reagent 抽提总RNA；②以oligo(dT)15反转录获得cDNA；③ 定量PCR：预变性95℃，10min；循环(40次)95℃，15s→60℃，60s；末段延伸60℃，5min；溶解曲线 75℃→95℃，每20s升温1℃;④ 结果处理：∆CT =CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)

结 果

1 60例患者细菌培养 60例均证实为铜绿假单胞菌感染病例，气管内肉芽或病变组织取材后PCR实验结果，均有algD、algB、algU、mucA基因的表达。

2 药物敏感实验结果 将60例病例分为耐药组(R组)和非耐药组(NR组)，algD、algU在两组间表达有统计学差异(P<0.05)，algB、mucA差异无统计学差异(P>0.05)，见表2。

3D组和E组△CT=CT目的基因-CTβ-actin比较 以临床治疗后症状体征是否容易改善，将60例病例分为容易组(E组)和困难组(D组)，两组间△CT均值对比的t检验提示，algD、algU、algB、mucA差异无统计学意义(P>0.05)

4 耐药和治疗难易相关性分析 对耐药和治疗难易的相关性分析显示(P<0.05)，说明耐药和临床难易有关。

表2 R组和NR组△CT=CT目的基因-CTβ-actin比较

讨 论

能形成生物膜的细菌主要有铜绿假单胞菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、沙雷氏菌属、肺炎链球菌、葡萄球菌等, 相关感染尤以铜绿假单胞菌、金葡球菌多见。

在肺部铜绿假单胞菌感染的抗生素治疗方面，抗生素的选择多是根据药物敏感实验的结果，该方法不一定奏效，因为临床细菌培养多采用浮游模式，而事实上呼吸道铜绿假单胞菌生长多是以细菌生物膜的方式形成黏液层。即使浮游状态细菌对抗生素敏感，生物膜状态的细菌则仍然能抵抗高浓度的“敏感”抗生素[1]。尽管目前尚无可靠证据，但理论上基于考虑生物膜形式而选择的抗生素，应该优于传统的细菌培养及药物敏感试验而选择抗生素[2]。

细菌生物膜感染的概念提出有数十年，目前尚未开发出能提供临床应用的生物膜常规检查和指导治疗的方法[3]。科学家们试图找到铜绿假单胞菌生长方式和控制机制，并提出避免生物膜形成或促进生物膜瓦解的方法[4]。

藻酸盐是铜绿假单胞菌生物膜胞外多聚基质的主要成分之一，algD基因对藻酸盐合成起关键作用，而mucA基因的突变可造成algD的去阻遏表达，使藻酸盐大量生成。铜绿假单胞菌藻酸盐形成的调控主要是转录水平对algD基因启动子的调控，algB属于NTRC家族，可直接绑定到algD启动子而促进藻酸钠生产[5]。

mucA-algU是铜绿假单胞菌生物膜合成的主要调控径路。mucA突变型菌株,algU不再受到抑制，从而促进下游启动子的活化。algU的过表达促进algD的启动，在铜绿假单胞菌黏液型菌株mucoidisolates和非黏液型菌株non-mucoidisolates表达有显著差异。

本实验患者均为选取细菌培养证实为铜绿假单胞菌感染病例，气管内肉芽或病变组织取材后PCR实验结果，均有上述相关基因的表达，而程度有差异。以药物敏感实验结果为标准，将病例分为耐药组(R组)和非耐药组(NR组)，algD、algU表达在两组间比较有统计学差异，algB、mucA差异无统计学意义；说明algD表达与生物膜合成最为相关，而直接影响培养细菌的耐药性，algU与algD表达有比较明确的正相关性。mucA表达下降可以解除对algU的抑制，从而促进algD表达，algB通过绑定algD启动子而促进藻酸盐的合成。本实验两组mucA、algB表达差异均无统计学意义，说明mucA、algB与algD之间可能缺少直接的因果关系。

至于分为容易组(E组)和困难组(D组)，各种基因表达的比较均没有统计学差异，以及耐药和临床难治有关的结论，由于分类标准的量化不能精确，并且临床治疗效果影响因素很多，除了性别、年龄、既往病史，甚至呼吸机的模式和护理水平均可能为混杂因素，所以不能得出非常可靠的结论。总之，algD与铜绿假单胞菌生物膜的合成有着直接的正相关性，可以作为判断是否有黏液型铜绿假单胞菌生长及生物膜形成的依据，而algU与algD有正相关性。

针对生物膜的治疗Yamasaki 等发现罗红霉素和亚胺硫霉素合用能有效杀灭金黄色葡萄球菌生物膜。罗红霉素和氟罗沙星对铜绿假单胞菌生物膜有明显抑制作用,两者合用可治疗由铜绿假单胞菌生物膜引起的难治性感染,其中罗红霉素通过抑制细菌多糖蛋白复合物合成来增强氟罗沙星对生物膜的渗透,对氟罗沙星杀灭生物膜中细菌起增效作用。体外实验证明乳铁蛋白协同木糖醇对铜绿假单胞菌生物膜有协同治疗作用。麦卢卡蜂蜜和肉桂油等均有此类治疗方面的研究。是否能以algU与algD的表达作为上述治疗效果的判断指标有待进一步的研究。

[1 ] Lebeaux D, Ghigo JM, Beloin C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2014,78(3):510-543.

[2] Waters V, Ratjen F. Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis[J].Cochrane Database Syst Rev,2015, 5(3):CD009528.

[3] Hφiby N.A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections[J]. Pathog Dis,2014,70(3):205-211.

[4] Rasamiravaka T, Labtani Q, Duez P,etal.The formation of biofilms by Pseudomonas aeruginosa: a review of the natural and synthetic compounds interfering with control mechanisms[J]. Biomed Res Int,2015,759348.

[5] Leech AJ, Sprinkle A, Wood L,etal. The NtrC family regulator AlgB, which controls alginate biosynthesis in mucoid Pseudomonas aeruginosa, binds directly to the algD promoter[J]. J Bacteriol,2008,190(2):581-589.

(收稿：2016-08-09)

Expression of alginate biosynthesis-related genes in respiratory Pseudomonas aeruginosa infection lesions Shaanxi Provincial People's Hospital Respiratory Medicine

(Xi’an 710005)

Chen Zhangqin Wang Jing Xu Yinglong et al

Objective：To obtain a respiratory Pseudomonas aeruginosa biofilm detection methods, explore the affect of the expression of the related alginate synthesis genes to the clinical treatment. Methods：Specimens were taken from the tracheal lesions of Pseudomonas aeruginosa infection cases, real-time quantitative PCR was performed to detect the expression of alginate biosynthesis-related gene algD, algB, algU, mucA. And correlation between gene algD, algB, algU, mucA. Expression and clinical treatment effect and antibiotic resistance was statistically analysed. Results：For all of the bacterial culture confirmed Pseudomonas aeruginosa infection cases, the alginate biosynthesis-related gene Expression was detected; comparison of resistant group (R group) and non-resistant group (NR group), algD, algU expression significantly difference, algB, mucA difference was not significant. Conclusion：Expression of algD and Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis has a direct positive correlation. Detect of algD can be used to determine whether there is Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. and the expression of algU have a positive correlation with algD.

Pseudomonas aeruginosa @algD @mucA+

*陕西省科学技术厅基金(2012k17-03-04)

铜绿假单胞菌 @algD@mucA+

R

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7377.2016.12.004

∆西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院