苹果醋混合菌种发酵工艺研究

杨 辉， 薛媛媛

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)



苹果醋混合菌种发酵工艺研究

杨 辉， 薛媛媛

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

以新鲜苹果为原料酿造苹果醋，研究了摇床转速、发酵温度和营养剂对发酵的影响，在此基础上，以产酸量为响应值，采用响应面分析法(RSM)对发酵工艺条件进行了优化.结果表明：苹果醋发酵的最适营养剂是玉米浆.苹果醋适宜发酵条件是温度31 ℃、摇床转速为204 r/min、营养剂添加量为11.12 mL/L，此条件下酿造的苹果醋其总酸含量达到4.45 g/100mL左右，橙黄透亮，酸味柔和，具有淡淡的苹果香味，品质优良.在分步发酵工艺的基础上研究了在酒精发酵期间醋酸菌接种时间对产酸量的影响.结果表明：在苹果酒发酵中期接入醋酸菌可以缩短苹果醋酿造周期，同时可提高产酸量.

苹果醋； 响应面； 醋酸杆菌属； 同步发酵； 营养剂

0 引言

中国是苹果生产大国，高居世界首位，而陕西苹果生产实现了面积产量品质全国第一，2011年的产量达到1 203万吨，占到全国苹果总产量的三分之一和世界总产量的八分之一，在世界苹果贸易中占有重要地位.但是我国丰富的苹果资源目前主要是以鲜食为主，约占总数的85%，且已经形成了生产过剩、效益下降、卖果难的局面[1].苹果醋具有软化血管, 预防心脑血管疾病等保健作用[2]，含有多种对人体有益的营养成分，具有水果和食醋的双重保健功能，不仅是一种保健饮料，且可以当成调味品.随着社会的进步，人们保健意识增强，饮食营养化、功能化变成饮食业发展的必然趋势.苹果醋酿造技术研究也成为苹果深加工的重点研究内容之一.赖颖等[3-5]对苹果醋饮料开发和调配工艺进行了研究.李莉等[6-9]均对苹果醋酿造条件进行了研究.郑宇等[10]对醋酸发酵营养盐的开发进行了研究.卢怡等[11，12]研究了多菌混合发酵酿造苹果醋的工艺，主要考察温度、接种量和糖度对苹果醋产量和品质的影响，傅亮等[13]研究了分步发酵和同步发酵两种发酵方法酿制苹果醋在发酵时间、酸度和感官评价上的差异，但对于同步发酵中醋酸菌的接种时机对苹果醋发酵的影响缺乏深入研究.代鹏等[14]以浓缩苹果汁为原料，将酒精发酵分为三个阶段，但也没有考虑到酒精发酵中周期的每一天醋酸菌的接入对酒精发酵的影响.尽管国内外对苹果醋的研究多不胜数，但在醋酸发酵中，对营养物质供给没有引起足够重视，因营养不足导致醋酸菌的生长缓慢、发酵难启动、酒精转化率低、发酵周期长、酒精和醋酸挥发损失严重等诸多问题[15]；在同步发酵中醋酸菌的接种时机掌控不准确，与营养物质供给相关的醋酸发酵工艺优化鲜为报道.

针对以上这些问题，本文研究摇床转速、发酵温度和营养剂等对发酵和苹果醋质量的影响，同时采用响应面法[16-21]对发酵工艺条件进行优化.在优化分步发酵工艺的基础上利用酵母菌与醋酸菌在适当条件下可以互补共生，采用多菌种酒精和醋酸同步发酵进行多菌发酵酿造苹果醋.与传统分步发酵相比，多菌混合发酵不仅能够避免中间产物过量积累对菌体的影响，而且还能简化工艺、降低成本缩短发酵周期，降低成本.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

(1)材料：苹果、白砂糖,市售；酵母,Zymaflore VL2； 醋酸杆菌,沪酿1.01；果胶酶、异Vc钠、氢氧化钠、无水硫酸铜、酒石酸钾钠、邻苯二甲酸氢钾、葡萄糖，均为分析纯，天津市天力化学试剂有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 苹果醋工艺流程

异Vc钠

↓

原料筛选→清洗切块→榨汁→果胶酶处理→

成分调整→酒精发酵→醋酸发酵→澄清→过滤→

↑ ↑

酵母 醋酸菌

装瓶→灭菌→成品

1.2.2 操作要点

(1)原料预处理：新鲜苹果经清洗后切成小块压榨，榨汁过程中添加0.2%的异Vc钠护色，防止果汁氧化变色，添加0.03%的果胶酶在50 ℃下保温1 h后加热至70 ℃～80 ℃灭酶10 min，进行澄清处理，冷却静置.

(2)发酵：按设计量称取酵母，依酵母质量∶果汁体积1∶10(g/mL)的比例与苹果汁混合，37 ℃水浴中保温，至有大量气泡冒出时活化完成，将其接入处理好的果汁中，于指定温度下发酵，当酒液表面平静、基本没有气泡逸出发酵结束.然后接入适量醋酸杆菌进行醋酸发酵.

(3)灭菌：装瓶后采用巴斯灭菌，70 ℃，15 min.

乡村旅游培训具有特殊性。与传统的农村职业教育侧重培养掌握某种适应当地经济发展的各类实用型农民目标不同，乡村旅游需要科学认识现代乡村旅游的特点，培训出具有服务意识和开放眼光，具有职业道德和职业精神，具有一定的管理能力和规范服务技能的乡村旅游从业农民[4]。乡村旅游发展需要与旅游市场走向与旅游行业发展趋势接轨，乡村旅游培训的主体已经从传统的普通从业农民向农民致富带头人转变，培训内容要做到发展理念与服务技能相结合。

1.2.3 单因素实验

沪酿1.01发酵温度为28 ℃～33 ℃，最高产酸量为50 g/L，故研究中选基础发酵温度为30 ℃，调整上述发酵好的苹果酒的酒精度为8%(v/v)，对影响醋酸菌发酵的摇床转速、发酵温度和营养剂进行单因素实验研究.

量取5份8%(v/v)苹果酒，在设定条件下发酵至酸度不在升高，每天定时测定酸度，以产酸量为指标确定适宜发酵条件.

(1)摇床转速的影响：分别置于50 r/min，100 r/min，150 r/min，200 r/min，250 r/min摇床转速下，30 ℃发酵.

(2)发酵温度的影响：调整摇床转速为150 r/min，分别置于25 ℃，28 ℃，31 ℃，34 ℃下发酵.

(3)不同营养剂的影响：调整摇床转速为150 r/min，30 ℃发酵.每天定时测定酸度，以产酸量为指标筛选出对苹果醋发酵影响最优的营养剂.

1.2.4 响应面试验

在单因素实验的基础上，以摇床转速、发酵温度、营养剂添加量为因素，产酸量为响应值，利用Design-Expert 8.05 软件根据 Box-Behnken 的设计原理，通过响应面分析，得到回归方程，进行最佳条件预测并进行实验验证.

1.2.5 酒精醋酸同步发酵实验

前期研究结果表明，苹果酒的发酵周期为5天，因此，分别在接入酵母菌的第1天、第2天、第3天、第4天，接入醋酸菌进行同步发酵实验，考虑到温度过高及摇床不断溶氧会降低酒精度的生成，所以在酒精发酵结束前进行静置发酵，结束后放入摇床培养.以发酵结束即第5天接入醋酸菌为对照，发酵过程中每天定时测定酸度，考察在苹果酒发酵的不同时期接入醋酸菌对于醋酸发酵的影响.

1.2.6 测定方法

总糖测定：费林法；酒精度测定：密度瓶法；总酸测定：电位滴定法；可溶性固形物( SSC)： 手持折光仪法；pH：酸度计法.

2 结果与讨论

2.1 摇床转速对苹果醋发酵的影响

图1给出摇床转速对苹果醋发酵的影响.结果表明，随着转速的增加，醋酸菌产酸能力增强.在200 r/min和250 r/min时产酸量最高分别达到4.55 g/100mL和4.56 g/100mL且发酵周期也最短，说明此时溶氧情况较好，对醋酸发酵十分有利.但当转速超过200 r/min后，产酸量增加很少，综合考虑发酵周期、产酸量、生产运行成本和产物损失等，选择摇床转速为200 r/min较为适宜.

图1 不同转速下醋酸发酵曲线

2.2 温度对苹果醋发酵的影响

图2给出温度对苹果醋发酵的影响.结果表明，温度越高，醋酸菌的产酸能力越强，其中31 ℃时达到最高为4.45 g/100mL，但超过31 ℃之后产酸量反而下降.因为过高的温度容易加快菌体老化，也导致部分乙酸挥发而损失.温度低，醋酸菌的代谢活动较弱，不能快速生长繁殖，发酵缓慢，产酸速率相对低，最终总酸量也偏低.所以，选择31 ℃为较适宜的苹果醋发酵温度.

图2 不同温度醋酸发酵曲线

2.3 不同营养剂对苹果醋发酵的影响

图3～5分别表示三种营养剂对苹果醋发酵的影响.结果表明，在添加0.45 g/L的复合无机营养盐，10 mL/L的玉米浆和0.15 g/L的复配麦芽糖醇酵母膏下的产酸速率比其他水平下的快，发酵周期短，且在此水平下的产酸量也为最高，依次为2.62 g/100mL、5.01 g/100mL和3.57 g/100mL.其中以玉米浆作为营养剂时醋酸菌产酸量最高.其原因可能是无机营养盐中虽含各种无机离子，但是营养成分单一，并不能满足菌体的生长代谢.麦芽糖醇酵母膏作为碳源和氮源的结合体，含有丰富的氨基酸、维生素、核甘酸、多肽及微量元素，效果较无机氮源好.

玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大约40%～50%固体物质.发酵中首先为微生物提供氮源(包括大分子蛋白质、大分子多肽、小分子多肽、多种单体氨基酸等)；其次提供微生物极易利用的有机溶磷；最后提供多种维生素和有机生长因子；另外还有多种无机微量元素.必要时蛋白质碳架可被作为碳源利用，且价格廉价，所以应该优先选择玉米浆作为苹果醋酸发酵的营养剂.

图3 不同复合无机营养盐用量时苹果醋发酵曲线

图4 不同麦芽糖醇酵母膏复配营养剂用量下的苹果醋发酵曲线

图5 不同玉米浆用量下苹果醋发酵曲线

2.4 响应面试验

为研究各因素共同作用下对苹果醋品质的影响，确定各工艺参数的最佳值，以产酸量(Y)为响应值，以发酵温度(A)、摇床转速(B)、营养剂添加量(C)作为影响因子，利用 Box-Behnken 法进行响应面试验设计，因素水平设计如表1所示，试验结果如表2所示.

表1 响应面分析因素与水平

表2 响应面分析试验设计及结果

利用Design-Expert 8.05 软件对试验结果进行处理分析，得到回归模型方程为:Y=4.45+0.029A+0.043B+0.19C-0.033AB+0.015AC+0.068BC- 0.16A2- 0.21B2- 0.22C2.对该模型的方差分析结果如表3所示.

表3 方差分析表

注：*表示显著(P<0.05)；**表示极显著(P<0.01)

由表3可见，该模型的P<0.000 1<0.01，表明回归方程极显著；模型的失拟项P=0.740 9>0.05，影响不显著.由方程可以看到一次项摇床转速B、营养剂添加量C影响极显著，发酵温度A影响显著，平方项A2、B2、C2的P<0.000 1<0.01影响极显著，说明这三个单因素各自对苹果酒发酵的影响特别明显.方程AB、AC的P>0.05，说明相互之间的交互作用不明显，应用该模型时可以不用考虑此两因素间的交互作用.而BC的P=0.005 0<0.01，表明交互作用极显著.模型的调整复相关系数R2Adj=0.979 6，说明该模型能解释约97.96%的响应值的变化，预测值和实测值具有高度的相关性，离散CV=0.80%，在可接受范围内，说明本实验操作准确可信.图6(a)、(b)、(c)分别是各因素间的交互作用图.图6(c)表明响应曲面较陡峭，等高线呈椭圆形，说明转速和营养剂添加量间的交互作用显著，对响应值的影响较敏感.

(a)温度和转速对总酸含量的响应面和等高线图

(b)温度和营养剂添加量对总酸含量的响应面和等高线图

(c)转速和营养剂添加量对总酸含量的响应面和等高线图图6 苹果醋发酵中各因素相互作用的响应面和等高线图

利用Design-Expert 8.05软件对回归模型分析得到，发酵温度A为31 ℃、摇床转速B为204 r/min、营养剂添加量C为11.12 mL/L为适宜发酵条件，此工艺条件下得总酸Y为4.49 g/100mL的苹果醋.以此条件进行验证试验，分别做三次平行试验取平均值，测得的酸度为4.45 g/100mL，与方程预测值非常相近，说明该方程与实际情况拟合良好，采用响应面分析法优化得到的苹果醋发酵参数准确可靠.

2.5 酒精醋酸同步发酵实验

图7表示在苹果酒发酵的不同时期接入醋酸菌对苹果醋发酵的影响.结果表明，同步发酵过程中，前6天处于延滞期，酵母菌的大量繁殖及溶氧量的不断减少抑制了醋酸菌的生长，随着酒精发酵的结束，提高摇床转速，升高发酵温度，6天后醋酸菌进入了对数生长期，酸度迅速上升，其中在进行酒精发酵的中期即发酵的第2、3天接入醋酸菌发酵周期最短，在第8天产酸达到最高，产酸量分别达到4.8 g/100mL、4.75 g/100mL.之后由于发酵液营养物质消耗殆尽，酸度开始慢慢下降，在第9天终止发酵.而分步发酵中即对照组，在第12天才发酵结束，产酸量为4.35 g/100mL低于同步发酵.因此采用同步发酵生产苹果醋不仅能够缩短发酵周期还可以提高产酸量.

从酒精发酵角度分析，随着发酵的进行，酒精度不断提高，酵母菌越来越明显的受到产物酒精的抑制，导致酒精代谢缓慢，从醋酸发酵分析，接种后，菌体适应发酵环境、繁殖需要一定的时间，如果在酒精发酵结束接入醋酸菌，完成醋酸发酵需要较长时间，而且，酒精发酵结束发酵温度下降不利于醋酸发酵，如果在酒精发酵进行到一定的程度，酒精度不是很高，酵母受到的抑制作用较小，发酵温度没有下降，发酵醪液中含有一定的糖、氨基酸等营养物质，有利于醋酸菌的繁殖生长，酒精发酵结束时，醋酸菌有一定增殖，少量产酸的条件下更有利于醋酸发酵的进行，可使醋酸发酵周期缩短.同时发酵中酵母为醋酸菌提供基质乙醇，而醋酸菌的繁殖消耗发酵液中的氧气，有利构成酒精发酵所需的厌氧环境，酒精发酵产热为醋酸菌的繁殖和代谢提供热量，有利于发酵温度的提高，酒精发酵结束，不分离酵母，醋酸发酵中酵母自溶，为醋酸菌提供蛋白质、氨基酸、多糖等丰富的营养物质.总之，同时发酵中存在着酒精、醋酸发酵的协同作用.

图7 不同醋酸菌接种方案时酒精-醋酸同时发酵曲线

3 结论

(1)以苹果鲜汁为原料酿造苹果醋，发酵温度、摇床转速和营养剂添加量对发酵影响极显著.苹果醋发酵的最适营养剂是玉米浆.

(2)响应面法优化可优化苹果醋发酵条件，在温度31 ℃、摇床转速为204 r/min、营养剂添加量为11.12 mL/L优化条件下，苹果醋总酸含量可达到4.45 g/100mL，其苹果香浓郁，澄清透明，风味独特，典型性明显.

(3)同步发酵试验表明，在酒精发酵的中期接入醋酸菌有益于总酸的生成，且能够缩短发酵周期.

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【责任编辑：蒋亚儒】

Study on the progress of apple vinegar by mixed fermentation with various bacterium

YANG Hui， XUE Yuan-yuan

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

In this study,fresh apple was used as raw material to brew apple vinegar,and the factors affecting apple vinegar fermentation such as rotary velocities,fermentation temperature,nutrients were investigated.Based on the studies above,the fermentation conditions were optimized through response surface methodology (RSM),using acid yield as a response value.The results show that corn syrup is the ideal nutritional agent for brewing apple vinegar.The optimal fermentation conditions are rotary velocities of 204 r/min,fermentation temperature of 31 ℃,the dosage of nutrient of 11.12 mL/L.Under these conditions,the brewed apple vinegar is of high quality,bright,clear,rich apple flavor,and the acid content of apple vinegar reaches 4.45 g/100mL.Based on the study of step by step fermentation,the effects of acetic acid bacteria inoculation time point during alcoholic fermentation on acid production were studied,the results show that inocultating acetic acid bacteria at the middle of cider fermentation can shorten the apple vinegar brewing cycle,and increase the yield of acetic acid.

apple vinegar； response surface； acetobacter； synchronization fermentation； nutrients

2016-07-11

科技部成果转化项目(2013GB2G000473)； 陕西科技大学学术带头人团队计划项目(2013XSD19)

杨 辉(1960-)，男，陕西西安人，教授，博士生导师，研究方向：生物材料和发酵工程

1000-5811(2016)06-0135-06

TS275.4

A