N末端B型脑尿肽前体检测用免疫层析检测系统的构建及应用

杨 冬, 高露莎, 郄玉涛，吴梦昕



N末端B型脑尿肽前体检测用免疫层析检测系统的构建及应用

杨 冬1, 高露莎1, 郄玉涛2，吴梦昕1

(1.陕西科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710021； 2.中国舰船研究设计中心， 湖北 武汉 430064)

N末端B型脑尿肽前体(NT-proBNP)是临床上用以判断心衰的良好心脏标志物，其高阴性预测值(100%)能很好的排除心力衰竭.磁性Fe3O4纳米粒子具有良好的生物相容性及超顺磁性，基于磁性Fe3O4纳米粒子构建的免疫层析系统，应可以满足定性检测需求，利用其磁性还有可能实现定量检测.因此，致力于制备免疫层析系统用的磁性Fe3O4纳米粒子，利用其表面含有的大量羧基为偶联位点，以碳二亚胺(EDC)作为连接子，将NT-proBNP抗体偶联于磁粒表面，可应用于血清样品中NT-proBNP的检测，其检测限可达100 pg/mL.

Fe3O4纳米粒子; 免疫层析检测; POCT检测

0 引言

心血管疾病一直是人类的健康杀手，其发病率和死亡率居高不下，并呈逐年上升趋势.在21世纪初，心血管疾病在发达国家死亡原因中约占一半，在发展中国家占25%.到2020年，心血管疾病每年将导致2500万人死亡，超过传染病，成为世界第一位死亡及伤残原因.在我国，世界卫生组织预测，到2020年中国心血管病的发病率将跃升至第二位，超过恶性肿瘤.因心血管疾病导致的死亡将占所有死亡的35%以上，庞大的心血管疾病患者群，给我国以及全球的医疗卫生事业带来了沉重的负担.其中，心力衰竭是所有心血管疾病的终末期表现，具有较高的死亡率[1,2].因此在较短时间内实现对心力衰竭患者的早期诊断和治疗监测非常重要.

研究已证明N末端B型脑尿肽前体(NT-proBNP)是判断心衰的良好的心脏标志物[3-5]，其高阴性预测值(100%)能使其很好的排除心力衰竭，提高了其对心力衰竭的诊断率[6,7].以NT-proBNP来判断心室功能，监测心力衰竭的药物治疗效果，判定心衰的预后和转归，寻找有效药物种类和剂量，有助于个体化医疗的实现.

目前测定血液样品中NT-proBNP的检测方法包括电化学发光法、免疫荧光法、放射免疫法及化学发光法等.这些方法具有灵敏度、精密度高及线性定量范围宽的优点，但成本昂贵、费时费力且对操作人员要求较高，而对心衰的判定往往需要“现场检测”或“近病人检测”，需要应用体外诊断试剂在数分钟内给出检测结果，即需要即时检测(Point-of-Care Testing,POCT)来完成.免疫层析作为常用的POCT诊断技术，具有简单、经济、快速的优点[8,9].然而，这种传统的侧流快速免疫分析技术固相标记物大多为胶体金，仅能提供定性或半定量的检测结果[10,11]，使其灵敏度和准确性受到极大的限制.

因此，本研究通过水热法制备了Fe3O4纳米粒子作为抗体标记载体，以心脏标志物NT-proBNP为检测目标，构建纳米体外诊断系统，获得最佳的检测灵敏度及特异性.

1 实验部分

1.1 主要试剂及原料

1.2 主要仪器

IKARCT磁力搅拌器，德国IKA公司；移液器，德国Eppendorf；鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;H165台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ5200DE超声波清洗器，江苏昆山超声仪器有限公司；超纯水仪，英国ELGA水处理技术有限公司；Zetasizer ZS-Nano激光动态散射仪，英国Malven仪器有限公司；Tecnai G2 S-Twin F20场发射透射电子显微镜，美国FEI有限责任公司；ZHWY-211C恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；XYZ-3050R划膜喷金仪，CM4000切条机，美国Biodot公司.

1.3 实验方法

1.3.1 Fe3O4纳米粒子的水热合成及表征

将1.632 0 g的FeCl3·H2O,0.687 4 g的Na3Cit及20 mL的EG混合，室温下搅拌10 min，形成透明溶液，加入1.203 5 g的NaOAc,搅拌均匀，转入50 mL的聚四氟乙烯反应釜中，密封.200 ℃反应10 h.将反应的产物以乙醇及水各洗涤三遍，在水溶液中定容至5 mL，4 ℃保存备用.

取1 mL制备的Fe3O4纳米粒子于真空烘箱过夜，称重.将制备得到的Fe3O4纳米粒子稀释成稀溶液，用移液器吸取30μL滴加在碳膜覆盖的铜网上，充分干燥后，在透射电子显微镜(TEM)下观察粒子分散度及表面形貌.

取一定量的Fe3O4纳米粒子于玻璃培养皿中，置于真空冷冻干燥过夜，取粉末样品进行X射线光电子能谱(XPS)分析，表征其成份组成.

将制备得到的Fe3O4纳米粒子稀释成稀溶液，以激光动态散射(DLS)测定其粒径及表面电位.

1.3.2 NT-proBNP检测用免疫试纸条的构建

免疫层析用试纸条的检测原理如图1所示，以PVC胶板为支持物，在硝酸纤维素膜(NC)两端分别将吸水纸，结合垫及样品垫(玻璃纤维膜)按次序粘到PVC板上，每个组件间应有1 mm的重叠.使用喷金划膜仪将捕获剂及质控剂分别喷涂于NC膜上预先定好的检测线(T线)及质控线(C线)上.将抗体标记纳米粒子形成的免疫探针溶液喷涂于结合垫上，装配好的试纸条装入密封的铝箔袋中，加入硅胶干燥包.

图1 免疫层析检测试纸条结构及检测原理示意图

1.3.3 基于Fe3O4纳米粒子免疫探针的制备

在20μL的EDC溶液(5 mg/mL)中加入150μL 硼酸缓冲液(BS，pH 8.5)，加入1 mg的Fe3O4纳米粒子，混匀.再加入15μg的NT-proBNP单抗，反应体系在180 rpm，23 ℃恒温摇床中反应1.5 h.加入500μL的封闭剂(含有0.1%的PEG 2 000，1% 的BSA及5%的小牛血清蛋白的BS缓冲液)，于180 rpm，23 ℃恒温摇床中反应1 h，BS溶液冲洗后定量至200μL.

1.3.4 抗体标记量的优化

取1 mg、2 mg、3 mg以及4 mg的Fe3O4纳米粒子定容至150μL，按照化学偶联法的操作步骤进行标记，将EDC的量固定为20μL(5 mg/mL)，NT-proBNP单抗的量固定为15μg，标记条件固定，以Lowry蛋白定量法测定偶联率.并将磁性免疫探针应用于免疫层析试纸条上，以灵敏度和显色的差异来确定最佳的抗体标记量.

1.3.5 抗体标记体系缓冲液pH的优化

取四支离心管，各加入2 mg的Fe3O4纳米粒子，以BS缓冲液冲洗及重悬，pH值分别为7.4、8.0、8.4及9.0，按照化学法的操作步骤，加入等量的EDC(20μL，5 mg/mL)及NT-proBNP(15μg)，于180 rpm，23 ℃恒温摇床中反应1.5 h，反应结束后以500μL的封闭剂，封闭1 h，BST溶液冲洗后定量至200μL.以Lowry蛋白定量法测定偶联率.将标记好的磁性免疫探针应用于免疫层析试纸条上，以显色的差异来确定最佳体系的pH值.

1.3.6 免疫层析系统的检测灵敏度及检测特异性

NT-proBNP检测用免疫层析试纸条的制备，需要预先将NT-proBNP(T线)作为捕获剂以及羊抗鼠IgG(C线)作为质控剂以喷金划膜仪划在NC膜上，划线溶液的浓度为1.5 mg/mL，喷涂速度6μL/cm，以正常人血清(阴性血清)为待检样品，比较条带的颜色差异，确定喷涂速度，以系列标准品作为待检样品，获得最佳检测限.

以血红素(10 mg/mL)，胆红素(3 mg/mL)，人白蛋白(3.5 mg/mL)以及甘油三酯(1.5 mg/mL)做为待检物，来确定NT-proBNP检测用免疫层析试纸条的检测特异性.

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4纳米粒子的表征

在醇体系中水热法可用以制备高质量的水相容性良好的磁性Fe3O4纳米粒子，EG这种高沸点溶剂在体系中用作还原剂以及稳定剂，用以调控纳米粒子的生长及防止团聚.Na3Cit用于晶体生长抑制以利于合成小尺寸的纳米粒子，其三羧基基团与Fe有很强的亲合作用，被固定于纳米粒子表面的羧基起到了表面修饰及稳定作用.因此，醇体系的水热合成方法具有操作简便、制备产物分散性好、水溶性及生物相容性好的特点[12].水热法制得Fe3O3纳米粒子的表征结果如图2所示.

(a)、(b)透射电子显微镜图(TEM)照片 (c)X射线光电子能谱(XPS)表征的表面元素组成图2 水热法制得的Fe3O4纳米粒子的表征结果

从图2(a)可以看出，采用水热法制备得到的Fe3O4纳米粒子呈球形、粒径分布均匀、分散性良好，通过Nano Measure计算，平均粒径为75.89 nm.从图2(b)可以看出，每个粒子都由更小的单晶构成，其晶胞参数为0.253 nm，与Fe3O4(311)晶面参数吮合.DLS检测表明，制备得的Fe3O4纳米粒子为电负性表面，zeta电位为-27.5 mV，其平均水合粒径为192.5 nm.为更准确的表征制备得到的纳米粒子的化学组成，以XPS表征材料Fe2+及Fe3+，从图2(c)可以看出，711及719 eV分别为Fe3O4中Fe2p3/2及Fe2p1/2的峰值[13,14].

2.2 以Fe3O4纳米粒子构建免疫探针

通过上述制备得到的纳米粒子表面的羧基，以EDC为连接子，将NT-proBNP单抗偶联于纳米粒子的表面，制备了基于Fe3O4纳米粒子的磁性免疫探针，图3所示为免疫探针的平均粒径分布图.如图3所示，在偶联了抗体后，粒径都有所增加.这是因为当蛋白与纳米粒子表面结合时，会改变粒子的布朗运动，因此可以在DLS测定的水合粒径的数值上体现出来.但从其平均粒径分布上可以看出，该探针依然具有良好的分散性，适用于下游免疫层析的检测.

图3 Fe3O4纳米粒子偶联NT-proBNP单抗后的粒径分布图

2.3 基于Fe3O4纳米粒子的免疫层析检测

依据检测原理可知：当样品中含有待检测物，即NT-proBNP抗体时，与磁性免疫探针上的单抗结合，一起流经T线时会与捕获抗原NT-proBNP多抗形成“检测显色剂-NT-proBNP抗体-捕获剂”的“三明治”结构，由于探针中Fe3O4纳米粒是带有颜色的粒子，在T线上会出现肉眼即可观察到的灰色条带.而在C线上出现的条带是羊抗鼠IgG二抗与免疫探针作用而产生的颜色.

将此探针喷涂于免疫层析试纸条.取60μL待检测样品滴加在结合垫上，实施NT-proBNP的体外检测.待检测样品以系列浓度的标准品为主，包括阴性血清(-)，阳性标准品(100 pg/mL、300 pg/mL和500 pg/mL).观察磁性免疫探针在结合垫上的释放性及用于抗体的检测结果.

将磁性免疫探针滴加在结合垫上，15 min后观察层析结果.从检测结果可以看出(如图4所示)，基于Fe3O4构建得到的磁性免疫探针在结合垫上及NC膜上得到了充分的释放，这是因为材料表面羧基偶联抗体，抗体蛋白在纳米粒表面形成的壳层保护而为探针提供了更好的保护层，使探针通过毛细管作用层析时能更好的通过NC膜孔隙，这为探针的构建与层析提供了更良好的基础.

1:为阴性血清； 2～4:分别为100、300和500 pg/mL的阳性血清图4 Fe3O4磁性免疫探针用于免疫检测的结果

共价偶联抗体，最易导致抗体在纳米粒子表面的无序性，优化抗体的标记量，是尽可能使纳米粒子表面的抗体结合量达到饱和，以利于促进抗体在纳米粒子表面更紧凑的结合方式，减少抗体无序所带来的空间位阻作用，减少结合能力下降的趋势[15].

在150μL的体系中，以等量的NT-proBNP单抗与不同量的Fe3O4纳米粒子反应，使偶联过程中抗体在纳米粒子表面形成不同的抗体表面浓度，导致表面偶联率不同，在检测中出现显色不同.表面浓度分别为15μg/mg、7.5μg/mg、5μg/mg及3.75μg/mg进行标记，所得的磁性免疫探针用于免疫层析检测所得的结果如图5(a)～(d) 所示.

从图5可以看出，当使用正常人血清进行检测时，四个浓度条件下所得的检测结果都没有出现假阳性，表明检测有效.分别以100 pg/mL、300 pg/mL以及500 pg/mL的标准品用于检测时，各组得到的检测结果略有差异.图5(a)中，即抗体加入量为15μg/mg时，三个浓度的标准品用于检测时，都可以在T线上看到条带，其检测限达到了100 pg/mL.其他组实验中，只有标准品浓度达到300 pg/mL时，才可以出现条带，而且随着单抗表面浓度的减少，其显色越来越弱.设NT-proBNP的分子量为8.36 KDa，1 mg磁性纳米粒子对应15μg单抗，则相当于700∶1=Ab∶NPs，抗体投入大大过量，因而不必再增加抗体量.因此，应当选取1 mg的Fe3O4纳米粒子进行标记.

(a)15 μg/mg

(b)7.5 μg/mg

(c)5 μg/mg

(d)3.75 μg/mg图5 不同抗体投入量构建免疫探针用于免疫层析检测的结果

在不同pH值的BS缓冲液中偶联NT-proBNP构建得到的免疫探针，用于免疫层析检测时，从图6的实验结果可以看出，随着缓冲液pH值的逐渐增大，T线上的显色更强，同时，结合垫上探针的释放效果良好.因此，选择高pH值的缓冲液对Fe3O4纳米粒子表面标记NT-proBNP，即BS缓冲液(pH 9.0).

图6 不同pH值缓冲液中Fe3O4纳米粒子标记NT-proBNP抗体制备免疫探针用于层析系统的检测结果

2.4 基于Fe3O4纳米粒子构建免疫层析系统的检测灵敏度及特异性

获得更高的检测灵敏度对提升检测性能是至关重要的，目前国际上普遍认同100 pg/mL为正常人血清中NT-proBNP的含量，大于300 pg/mL可能会发生早期心衰[16].在一系列的优化条件配置下，以系列浓度的标准品作为待检样品时，获得的检测结果如图7所示，在阳性血清浓度为100 pg/mL时，试纸条存在肉眼可见条带，因此定性检测的检测限为100 pg/mL.

由于采用血清做为待检测样品，根据双抗夹心原理和使用时有可能遇到的样品干扰物，以及结合文献中提及的可能的干扰物质，选择血红素(10 mg/mL)、胆红素(3 mg/mL)、人白蛋白(3.5 mg/mL)以及甘油三酯(1.5 mg/mL)做为待检物，进行干扰实验.检测结果如图8所示，高浓度的干扰物质用于NT-proBNP检测用免疫层析系统时，没有出现T线，即干扰物质不会对检测结果产生影响.该免疫层析系统对NT-proBNP抗体的检测是高度特异性的.

图8 NT-proBNP-Fe3O4免疫探针构建的免疫层析试纸条特异性检测(从左至右分别为用于血红素(10 mg/mL)、胆红素(3 mg/mL)、人白蛋白(3.5 mg/mL)及甘油三酯(1.5 mg/mL)的检测时呈阴性)

3 结论

本文采用自制的Fe3O4纳米粒子构建免疫层析系统，双抗体夹心法实现血样中NT-proBNP的定性检测.由于免疫层析检测技术具有便捷、快速、可肉眼观察检测结果、无需要专业设备及人员的特点，是典型的POCT检测方法，目前已经广泛的用于免疫学、食品安全、环境监测领域.以Fe3O4纳米粒子为载体构建的层析检测系统对免疫层析技术及对Fe3O4纳米粒子在生物医学的应用都有重要的意义.

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【责任编辑：陈 佳】

Construction and application of lateral flow immunoassay system for NT-proBNP detection

YANG Dong1, GAO Lu-sha1, QIE Yu-tao2, WU Meng-xin1

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.China Ship Development and Design Center, Wuhan 430064, China)

Due to its high sensitive and negative predictive value (100%) to confirm the diagnosis of heart failure in patients,amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP) is widely used as a clinical heart marker.Fe3O4nanoparticles have attracted considerable interest in biomedicine fields due to their biocompatibility and superparamagnetism.Comparing with traditional immune chromatography system based on colloidal gold nanoparticle,lateral flow immunoassay stemming from magnetic nanoparticle can satisfy not only qualitative detection, but quantitative testing by using is magnetism.Therefore, this research is devoted to the construction of magnetic immune chromatography system in which Fe3O4nanoparticles containing a large number of carboxyl groups as an antibody labeling materials,1-(3-dimethyllaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)was explored as a linker to achieve chemical bond and NT-proBNP as a testing target.By optimizing the processes,the detection limitation of LFIAs strips based on magnetic nanoparticles was as low as 100 pg/mL.

Fe3O4nanoparticle; lateral flow immunoassay; point-of-care testing

2016-10-14

国家自然科学基金项目(21505089); 陕西科技大学博士科研启动基金项目(BJ15-17)

杨 冬(1979-)，女，河南郾城人，副教授，博士，研究方向：生化分析及生物传感、纳米及介观结构

1000-5811(2016)06-0098-06

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