柴胡疏肝散对肝气郁结证大鼠海马及下丘脑单胺类神经递质的影响

马玉峰，王嘉麟，邢 佳，朱晓晨，岳广欣，王玉来，郭蓉娟，贺立娟



·基础医学论著/研究·

柴胡疏肝散对肝气郁结证大鼠海马及下丘脑单胺类神经递质的影响

马玉峰1，王嘉麟2，邢 佳2，朱晓晨2，岳广欣3，王玉来2，郭蓉娟2，贺立娟2

目的 研究柴胡疏肝散对肝郁证大鼠行为学和大鼠海马及下丘脑单胺类神经递质的影响。方法 用慢性束缚应激结合孤养法建立肝郁证大鼠模型，测评开野、蔗糖水实验，采用高效液相色谱法测定大鼠海马及下丘脑单胺类神经递质。结果 模型组大鼠的行为学发生了明显变化，海马及下丘脑中5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺(DA)含量均下降，去甲肾上腺素(NE)含量呈增加趋势，而柴胡疏肝散能调控其变化趋势。结论 柴胡疏肝散能改善肝郁证大鼠行为学的变化，具有治疗肝郁证的作用，其作用机制可能与其能够调节肝郁证大鼠脑5-HT、5-HIAA、NE、DA有关，从而有效发挥抗肝郁作用。

肝气郁结证；柴胡疏肝散；单胺类神经递质；5-羟色胺；5-羟吲哚乙酸；多巴胺

本实验用慢性束缚应激结合孤养法建立了肝气郁结证(肝郁证)大鼠模型，观察柴胡疏肝散对该模型行为学和大鼠海马及下丘脑单胺类神经递质的影响，为进一步探讨肝郁证的内涵提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠40只，体重180 g±10 g，SPF/VAF级，动物许可证号：SCXK(京)2006-0009，由北京维通利华实验动物中心提供。光照节律12L：12D (07：00～19：00)，室温22 ℃±1 ℃，空气湿度40%～50%，给予常规颗粒饲料及饮用水，实验环境安静舒适。适应性饲养1周，5只/笼。

1.2 药物 本实验所用柴胡疏肝散出自《景岳全书·古方八阵》，组方：柴胡6 g，陈皮6 g，川芎5 g，香附5 g，枳壳5 g，白芍5 g，甘草3 g。由解放军总医院中药房提供，经药剂科鉴定均为正品，经冷水浸泡药材2 h，常规两煎，头煎30 min，二煎20 min，将两次水煎液混合并过滤，经水浴蒸发浓缩成含生药0.52 g/mL的浓缩药液冷藏备用。大鼠给药剂量按人与动物体表面积折算(参考《药理实验方法学》第4版)，灌胃容积按1 mL /100 g换算。

1.3 仪器 美国ESA公司的5600A型高效液相色谱系统；8通道库仑电化学检测器(Model 5600A Coularray Detector-8)；电极：ESA Model 6210 fourchannel cell；582型泵；软件：ESA Software Version；Sigma-3K15超速低温离心机；NANOpure Diamond超纯水机；MJ-300超声波发生器；AG285电子分析天平；KONTES微量电动匀浆器；自制敞箱(80 cm×80 cm×40 cm)。

1.4 试剂 蔗糖(分析纯，北京化学试剂有限公司提供)，溶于蒸馏水中配制成1%蔗糖溶液；去甲肾上腺素(NE，sigma A9512)；3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC，sigma 850217)；多巴胺(DA，sigma H8502)；高香草酸(HOMV，sigma H1252)；5-羟色胺(5-HT，sigma 9523)；5-羟吲哚乙酸(5-HIAA，sigma H8876)；3，4二羟基苄胺(DHBA，sigma 37616)；1-辛烷磺酸钠(TEDIA)；一水柠檬酸；乙腈(Thermo)；高氯酸；焦亚硫酸钠；乙二胺四乙酸，实验用水为超纯水。

1.5 方法

1.5.1 模型建立及分组 40只大鼠适应性饲养1周后，进行开野实验(Open-field test)，将合格且评分相近的30只大鼠随机分为3组：空白对照组(对照组)、肝郁证模型组(模型组)、柴胡疏肝散组(治疗组)，每组10只。模型建立：参照文献[1-3]，用慢性束缚应激结合孤养法建立肝郁证大鼠模型。将造模大鼠放入特制的细钢丝网笼内，使其行走困难、活动受限，束缚笼空间大小可调节；随之将被束缚的大鼠放入小型鼠笼，1只/笼。每日束缚制动1次，每次束缚6 h(其余时间单笼孤养)，每日开始时间随机，连续21 d。造模大鼠在束缚期间禁食水。

1.5.2 干预措施 对照组：群养，5只/笼，不做任何刺激，生理盐水灌胃，每日1次；模型组：细钢丝网笼束缚结合孤养，生理盐水灌胃，每日1次；治疗组：细钢丝网笼束缚结合孤养，柴胡疏肝散煎剂(0.52 g/mL)灌胃，每日1次。自造模之日起开始灌胃，灌胃时间为21 d。

1.5.3 行为学测定 开野实验，用Open-field test法进行测试。由两位评定者评定每只大鼠在3 min内的运动情况。蔗糖水实验[4]，分别在造模前1 d和造模第22 天测定各组大鼠的蔗糖水偏好值[糖水偏好值=糖水消耗量/总液体消耗量×100%]。

1.5.4 前额叶皮质、海马单胺类神经递质含量变化

1.5.4.1 组织样品制备 3组实验大鼠均于末次给药第2天上午，10%水合氯醛麻醉后断头处死，从枕骨大孔向口腔侧进刀，剪开颅骨，剥去头顶骨，剪断视神经，用镊子取出整个脑组织，迅速以预冷的人工脑脊液冲去脑组织表面的血液，用滤纸吸去血液及多余的脑脊液。参照George Paxions的大鼠脑立体定位图谱[5]定位，在冰盘上剥离大脑，取前额叶皮质、海马及下丘脑，标记称重后分别装入1.5 Ml Eppendorf管，放置于液氮或-80 ℃冰箱保存，待样品集齐后成批检测。检测前将称重后的脑组织(20 mg～50 mg)，加0.5 mL预冷的工作内标液，于冰浴下用电动微量匀浆器快速匀浆，静置10 min，4 ℃条件下14 000 r/min低温离心15 min，取上清液，用Millipore 0.22 μm针头式过滤器过滤，放入自动进样器中待测。神经递质含量按ng/g组织重量计算。

1.5.4.2 色谱条件 预柱：ESA HR-80，4.6 cm×8 cm；色谱柱：ESA MD-150(3.2 mm×150 mm)；流动相：90 mmol/L 磷酸二氢钠， 1.7 mmol/L 1-辛烷磺酸钠，50 mmol/L 柠檬酸，50 μmol/L EDTA，10% 乙腈，pH 约为3.00。流速：0.6 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30 ℃；设置4道电势分别为：-150 mV、200 mV、350 mV、500 mV。

2 结 果

2.1 行为学变化 模型组大鼠水平运动、垂直运动得分明显下降，粪便粒数增多，与对照组相比有统计学意义(P<0.01)，中央格停留时间有上升趋势；而治疗组大鼠水平运动得分、垂直运动得分均高于模型组，粪便粒数减少，与模型组比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，中央格停留时间有减少趋势。造模前组间比较无差异；造模21 d后，与对照组相比，模型组大鼠蔗糖水偏好值明显下降(P<0.01)；而治疗组大鼠蔗糖水偏好值高于模型组(P<0.05)。详见表1。

表1 各组开野实验、蔗糖水实验结果(±s)

2.2 海马及下丘脑单胺类神经递质含量变化

2.2.1 海马单胺类神经递质含量变化 模型组海马中5-HT、5-HIAA与DA含量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，NE与对照组相比呈增加趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；治疗组与对照组海马中5-HT、5-HIAA、DA、NE含量相比差异无统计学意义(P>0.05)；治疗组与模型组相比，5-HT、5-HIAA与DA含量均增加，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，NE含量呈减少趋势，但无统计学意义(P>0.05)。详见表2、图1。

表2 各组海马5-HT、5-HIAA、DA、NE含量比较(±s) ng/g

图1 实验大鼠海马样本5-HT、5-HIAA、DA、NE色谱图

2.2.2 下丘脑单胺类神经递质含量变化 模型组下丘脑中5-HT、5-HIAA与DA含量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，NE与对照组相比呈增加趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；治疗组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；治疗组与模型组相比，5-HT与DA含量均增加，差异有统计学意义(P<0.05)，5-HIAA含量呈增加趋势，NE含量呈减少趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3、图2。

图2 实验大鼠下丘脑样本5-HT、5-HIAA、DA、NE色谱图

3 讨 论

研究认为肝气郁结证(肝郁证)是在压抑、焦虑、悲痛等负性情绪心理应激状态下，以高级神经中枢调节机制紊乱为前提，对神经、内分泌、循环、消化、免疫、感觉、运动等多系统病理改变、病证表现的概括[6]。柴胡疏肝散出自《景岳全书》，原方用于“治胸胁疼痛，寒热往来”，是临床治疗肝气郁结证的古典名方。由柴胡、陈皮、川芎、香附、枳壳、芍药、炙甘草七味中药组成，具有疏肝解郁，行气止痛之功效。本实验用慢性束缚应激结合孤养法成功建立了肝郁证大鼠模型，其行为学表现主要是情绪低落、兴趣减退、活动度降低、探究行为减少以及体重增加缓慢、摄食量减少、大便异常等。慢性制动是研究心理应激的一个较为可靠的方法，特别是用于研究中医所述的“郁怒伤肝，肝失疏泄”的病理改变[7]。模型组大鼠水平运动、垂直运动得分明显下降，提示其活动度及好奇程度均下降，而柴胡疏肝散可改善其变化。蔗糖水偏好值下降与快感缺乏密切相关。模型组大鼠蔗糖水偏好程度下降，提示其对美味食物(蔗糖水)快感缺乏，而柴胡疏肝散组未见快感缺乏。单胺类神经递质是中枢神经系统中的一类神经递质，包括5-HT、DA、NE、肾上腺素(A)、组胺等。其中，5-HT、DA与NE有着非常重要的生理功能，三者相互影响，其作用十分广泛，主要与精神活动、行为及情绪等密切相关，对哺乳动物的神经系统功能、内脏功能及应激反应，尤其是对中枢神经系统的兴奋或抑制起着协调作用[8]。单胺类信号扰动可以改变成年人的行为：在出生后早期，5-HT敏感期，单胺类信号扰动可影响焦虑和抑郁症相关的行为；在围青春期，5-HT和DA敏感期，单胺类信号扰动可改变攻击性[9]。单胺类神经递质在非典型抑郁症和抑郁症的亚型中有不同的影响[10]。

5-HT是一种抑制性神经递质，参与对情感、睡眠、警觉、食欲、记忆等多种生理功能的调节，还可对体温、镇痛及心血管功能产生影响，作用的不同可能与其释放后结合的受体不同相关。功能失调性5-HT的节律可能是抑郁症的一种常见的端点和生物标志物[10]。目前认为在应激状态下动物脑内可出现5-HT更新加速的现象；而在脑内的5-HT活性降低时，机体对各种应激刺激的敏感性则会增加，从而易受伤害以致引起多种精神症状。Azmitia等[11]认为，在应激状态下下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴功能亢进，增高的糖皮质激素则通过诱导肝脏中的色氨酸吡咯化酶，降解血浆中的色氨酸，从而调整中枢的色氨酸不足及5-HT合成低下。当5-HT功能过度低下时，HPA轴过度亢进，糖皮质激素的升高会造成大脑的损伤，进而导致了情绪低落、兴趣减退等抑郁症状的发生；同样，当HPA轴功能不足时，也会导致5-HT的功能低下。大量研究表明NE与情志活动有密切关系，NE不但可以作为肝郁证动物模型的反证指标之一，而且也是探讨肝郁导致精神情志异常的机理的主要指标之一。当NE系统功能紊乱时，对应激适应的失败则可导致焦虑和抑郁症状[12]。鲁明等[13]用夹鼠尾法建立肝郁证大鼠模型，检测正常组、模型组及柴胡疏肝散治疗组的大鼠脑干NE的变化，结果发现模型组大鼠脑干的NE含量明显升高。DA既是NE的前体，又是一种重要的独立神经递质。中脑DA能神经元对躯体运动有调节作用，对垂体内分泌功能和心血管功能有一定调节作用，还参与神经活动的调节，尤其是中脑边缘皮质DA系统在情绪和精神活动中发挥重要作用。

本研究结果表明：模型组大鼠的行为学发生了明显变化，海马及下丘脑中的5-HT、5-HIAA、DA含量均下降，NE含量呈增加趋势，而柴胡疏肝散能调控肝郁证大鼠脑5-HT、5-HIAA、NE、DA变化趋势，从而有效发挥抗肝郁作用。以上实验结果说明，肝郁证模型大鼠海马及下丘脑的单胺类神经递质5-HT、5-HIAA、DA、NE，与对照组、治疗组相比呈现出不同的变化特点，说明肝的疏泄功能与5-HT、5-HIAA、DA及NE有关；柴胡疏肝散抗肝郁作用可能与调控5-HT、5-HIAA、DA及NE等单胺类神经递质有关。

综上所述，柴胡疏肝散能有效改善肝郁证模型大鼠的行为学变化，对其海马及下丘脑单胺类神经递质有调控作用。柴胡疏肝散等中药复方治疗情志类疾病临床疗效显著，但其作用机制尚未明确，并不局限于对单胺类神经递质的调控，值得进一步探讨。

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(本文编辑郭怀印)

Effects of Chaihu Shugan Power on the Levels of Monoamine Neurotransmitters in the Hippocampus and Hypothalamus in Rats with Liver-qi Stagnation Syndrome

Ma Yufeng,Wang Jialing,Xing Jia,Zhu Xiaochen,Yue Guangxin,Wang Yulai,Guo Rongjuan,He Lijuan

Third Affiliated Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

He Lijuan (Dongfang Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,China)

Objective To study the effects of Chaihu Shugan powder (CSD) on the ethological changes and levels of monoamine neurotransmitters in the hippocampus and hypothalamus in rats with liver-qi stagnation syndrome.Methods The rat model with liver-qi stagnation syndrome was established by chronic restraint stress and keeping them alone.Each rat was reviewed by Open-field test,Sucrose test and determined the levels of monoamine neurotransmitters in the hippocampus and hypothalamus by high performance liquid chromatography (HPLC).Results The ethological manifestation of model rats was changed obviously,and the levels of 5-hydroxytryptamine (5-HT), 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA),dopamine(DA) in the hippocampus and hypothalamus were decreased,while the level of norepinephrine (NE) was increased.CSD could regulate its trends.Conclusion CSD can improve the model rat’s ethological manifestation and have therapeutic effects of liver-qi stagnation syndrome.The mechanism may be adjust the levels of 5-HT,5-HIAA,NE,DA in rat brain with liver-qi stagnation syndrome,in order to effectively play the role of anti-liver-qi stagnation.

liver-qi stagnation syndrome;Chaihu Shugan power; monoamine neurotransmitters; 5-hydroxytryptamine; 5-hydroxyindoleacetic acid;dopamine

国家自然科学基金资助项目(No.30973706)；贺立娟青年教师专项(No.2013-QNJSZX016)

1.北京中医药大学第三附属医院(北京 100029)；2.北京中医药大学东方医院；3.中国中医科学院

贺立娟，E-mail：ljhebj@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.21.008

1672-1349(2016)21-2494-04

2016-07-21)

引用信息：马玉峰，王嘉麟，邢佳，等.柴胡疏肝散对肝气郁结证大鼠海马及下丘脑单胺类神经递质的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(21)：2494-2497.