全氟辛烷磺酸和全氟辛酸对秀丽隐杆线虫的生殖毒性

简子海，戴抒豪，王雪菲，杨子杰，陆 强，杨正龙，阿吴英·哈得勒别克，尹立红，刘 冉*

（东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，江苏 南京 210009）

全氟辛烷磺酸和全氟辛酸对秀丽隐杆线虫的生殖毒性

简子海，戴抒豪，王雪菲，杨子杰，陆 强，杨正龙，阿吴英·哈得勒别克，尹立红，刘 冉*

（东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，江苏 南京 210009）

全氟羟基物质是一类新型持久性有机环境污染物(persistentorganic pollutants，POPs)，在生物降解作用下，其在环境中不断积累，并随着食物链进行生物放大作用[1]。在过去的几十年，全氟羟基物质被广泛用

于工业生产和产品中，使其在水、植物、各种食物、动物[2]等环境介质中均有检出。全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)和全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)是全氟羟基物质中最具代表性的两种物质。PFOS和PFOA在工业和生活中的广泛应用造成了严重的环境污染，引起了全世界的关注。美国在2003-2004年调查[3]发现人体血清PFOS的浓度为：0.4～435μg/L，PFOA的浓度为：0.1～77.2μg/L。 2001年美国将PFOS列入环保署持久性有机污染物黑名单，2006年欧盟发布了《关于限制全氟辛烷磺酸销售及使用的指令》，2009年5月，联合国环境规划署持续性有机污染物审查委员会将PFOS和PFOA列入了《斯德哥尔摩公约》附件B中。

研究表明PFOS与PFOA具有生殖毒性[3]。有报道称高浓度的PFOS对精子完整性[4-5]和性激素结合球蛋白[6]水平有影响，同时有研究表明子宫内暴露PFOA后影响子代精子质量，但PFOS无影响[7]。PFOS和PFOA在工业上的大量生产和广泛应用，严重影响生态系统健康，威胁生物物种多样性，运用动物模型来研究其毒性的方法已经成为了一种趋势。秀丽隐杆线虫(以下简称线虫)是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫，具有遗传背景清楚、繁殖周期短、身体透明、能呈现出减数分裂过程中的各种变化，使其在生殖细胞的研究中具有很多与生俱来的优势[8]。通过多种暴露介质(如土壤、水和淡水沉淀物等)，秀丽隐杆线虫被用于大量的生态毒理学研究中，可以利用线虫观察多种不同的毒理学实验终点(死亡率、生殖、行为等)[9]。Ruan等[10]通过线虫暴露氯氰菊酯，结果显示秀丽隐杆线虫生殖和产卵能力降低、繁殖率减弱，提示线虫生殖系统对外源性化学物具有一定敏感性。此外，秀丽隐杆线虫还具有分化完整、结构简单的生殖系统和较哺乳动物简单的生殖发育过程，使其可以在相对简单的生殖发育背景下开展相应的生殖毒性研究。

因此，本研究应用秀丽隐杆线虫模型分析PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫的后代数目和世代时间的影响，观察秀丽隐杆线虫生殖系统对PFOS和PFOA的敏感性，探讨环境生物PFOS和PFOA暴露后生殖毒性的敏感指标，从而为PFOS和PFOA的生态毒性以及环境监测提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 秀丽隐杆线虫虫株

N2线虫，购于秀丽隐杆线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetic Center，CGC)。

1.2 主要试剂

琼脂、多聚蛋白胨、胆固醇，购于Sigma-Aldrich公司；酵母提取物、胰蛋白胨，购于英国OXOID公司；全氟辛烷磺酸(PFOS，98%)、全氟辛酸(PFOA，96%)均为白色粉末，购于上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 PFOS和PFOA分别设置高、中、低3个剂量组，浓度依次为0.1、0.01、0.001mmol/L，用M9溶液配制，同时设置M9空白对照组。

1.3.2 L4期幼虫染毒方法 每个剂量组分别吸取200 µL染毒液到24孔板中，轻微震动24孔板使其均匀铺开，将同步化后L4期的N2线虫虫液打到24孔板中，20℃恒温培养箱中染毒24h，染毒结束后每个剂量组挑取10条线虫，观察其世代时间和后代数目。

1.3.3 L1期幼虫染毒方法 每个剂量组分别吸取200 µL PFOS或PFOA染毒液到24孔板中，轻微震动24孔板使其均匀铺开，将同步化后L1的幼虫虫液打到已接种有OP50菌液的24孔板中，20℃恒温培养箱中染毒48h，染毒结束后每个剂量组挑取10条线虫，观察其世代时间和后代数目。

1.3.4 后代数目(brood size)测定 染毒结束后，用挑针将虫子分别挑入种菌的培养基中产卵，期间每隔36h转至新的培养皿，并计数旧皿后代数目，直至停止产卵为止，统计每条线虫发育为成虫后产生的所有子代数目。

1.3.5 世代时间(generation time)测定 每个染毒剂量组统计10条线虫后代数目，将染毒后的线虫挑入已种菌的培养基表面，观察并记录线虫成虫产第1个卵的时间，此时刻记为a，继续观察该卵发育长成成虫后，其产出第1个卵的时间，此时记为b，a和b的时间间隔即为线虫的世代时间。

1.4 统计分析

数据统计利用SPSS 17.0软件处理，组间比较采用单因素方差分析，剂量组与对照组的两两比较采用Dunnett-t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 L4期幼虫PFOS和PFOA染毒对秀丽线虫生殖毒性的影响

同步化后L4期幼虫经PFOS和PFOA分别染毒24h后，与空白对照组比较，PFOS高、中剂量组后代数目差异有统计学意义(P<0.05)；PFOA 3个剂量组后代数目差异均有统计学意义(P<0.05)，但均未显示剂量反

应关系。同步化后L4期幼虫经PFOS和PFOA分别染毒24h 后，PFOA和PFOS的3个剂量组秀丽线虫的平均世代时间在61.60～66.30h 之间，与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 L4期幼虫PFOS和PFOA染毒后秀丽线虫的后代数目和世代时间(±s)

表1 L4期幼虫PFOS和PFOA染毒后秀丽线虫的后代数目和世代时间(±s)

与空白对照组相比，*P<0.05.

2.2 L1期幼虫PFOS和PFOA分别染毒对秀丽线虫生殖毒性的影响

同步化后L1期幼虫染毒48h后，与空白对照组比较，PFOS高、中剂量组后代数目差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量反应关系(R2=0.963，P<0.05)；PFOA高、中剂量组后代数目差异有统计学意义(P< 0.05)，但未显示有剂量反应关系。同步化后L1期幼虫染毒48h后世代时间均在61.94～72.30h之间。与空白对照组比较，PFOS 的3个剂量组世代时间差异有统计学意义，且呈剂量反应关系(R2=0.955，P<0.05)； PFOA的3个剂量组差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 L1期幼虫PFOS和PFOA分别染毒后的后代数目和世代时间(±s)

表2 L1期幼虫PFOS和PFOA分别染毒后的后代数目和世代时间(±s)

3 讨 论

PFOS和PFOA是公认的持久性有机污染物，已有研究表明其具有多种毒性，其生殖毒性是本研究的重点。PFOS和PFOA对雄性生物体的生殖毒性主要表现为影响精子的正常发育成熟[8-10]、破坏血睾屏障的结构[11-12]、抑制睾酮合成[13-14]；雌性生殖毒性主要表现为对怀孕母体和子代的危害。文永霞等[15]研究表明新生发育期的雌性大鼠慢性PFOS染毒，会出现生长发育缓慢、生育期繁殖能力下降以及不孕不育的症状，且该毒性可遗传至子代。Lee等[16]研究发现，婴儿出生后的体质量、体长与其母亲血清PFOS和PFOA水平呈负相关，说明其可能对婴儿的生长发育产生影响。

目前，对于PFOS和PFOA生殖毒性的研究，通常选用哺乳动物(大鼠)、禽类(鹌鹑)以及水体生物(斑马鱼)等作为实验动物，这些动物生命周期较长，性成熟时间和繁殖周期相对较长，要求相对较长的研究周期。与上述实验动物相比，秀丽隐杆线虫生长周期短、繁殖能力强、易于饲养，对于PFOS和PFOA生殖毒性的研究有较大的优势。

L4期线虫约经18h发育为成虫，进入产卵期，因此受精卵的数目对其后代的数量有着重要的影响，在此期间对其进行24h染毒，可探究PFOS和PFOA对其受精卵产生的影响。L1期为秀丽线虫开始生长发育的时期，大概46h后达到L4期，在L1期PFOS和PFOA染毒48h，可探讨线虫发育期全程PFOS和PFOA暴露是否可能通过影响其生殖系统的发育进而表现出生殖毒性，同时可模拟人类从婴幼儿期到成年期接触PFOS和PFOA对其生殖系统发育产生的影响。本研究以N2线虫为研究对象，以PFOS和PFOA为受试物，对同步化后L4期线虫染毒24h，对同步化后L1期线虫染毒48h，以后代数目和世代时间作为其生殖毒性的评价指标。研究发现线虫至少有38%的蛋白编码基因与人类基因同源，用线虫研究PFOS和PFOA的生殖毒性可以间接地反映其对人类的生殖毒性。有研究表明孕期三氯生暴露对线虫的世代时间和后代数目均有显著影响[17]。壬基酚暴露可使线虫世代时间延长，而后代数目无明显改变[18]。

本研究结果显示，L4期线虫染毒24h后，与对照组比较，PFOS高、中剂量组和PFOA各剂量组后代数目均有明显差异(P<0.05)，PFOS和PFOA各剂量组世代时间差异均无统计学意义 (P>0.05)。L1期幼虫染毒48h后，与对照组比较，PFOS和PFOA中、高剂量组后代数目差异有统计学意义(P<0.05)，PFOS的3个剂量组世代时间差异均无统计学意义(P>0.05)，表明PFOS对发育期的线虫具有生殖毒性，使其世代时间延长、后代数目减少，且暴露浓度越大，毒性越强。实验结果说明L1期幼虫比L4期幼虫对PFOS和PFOA更敏感，PFOS和PFOA在线虫幼年期发育全程暴露可显著诱导其生殖毒性，后代数目是PFOS和PFOA生殖毒性的敏感指标，世代时间对PFOS暴露比L4期幼虫更敏感，但PFOA不影响线虫的世代时间。可能是因为L1期线虫生殖系统未发育完善，比L4期线虫对外源化学物更敏感，L1期到成虫期线虫体内累积的PFOS和PFOA更多，所以产生的毒性更强，PFOS和PFOA可能是通过影响线虫生殖系统的发育而产生生殖毒性。此外由L1期染毒数据看出PFOS与PFOA对线虫的抑制作用不同，这与PFOA和PFOS对大型蚤急性毒性试验研究[18]结果类似。PFOS和PFOA都是C8全氟化合物，PFOS的官能团为-S(=O)2-F，PFOA的官能团为-COOH，在生殖毒性上的差异是否与其化学结构的差别有关，还需要在后续的实验中证实。

[1] Buck RC，Franklin J，Berger U，etal.Perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substancesin the environment：terminology，classification，and origins[J].Integr Environ Assessmanag，2011，7(4)：513-541.

[2] Domingo JL.Health risks of dietary exposure to perfluorinated compounds[J].Environ Int，2012，40：187-195.

[3] 李玲，赵康峰，李毅民，等.全氟辛烷磺酸和全氟辛酸神经毒性机制研究进展[J].环 境卫生学杂志，2013(2)：167-169.

[4] Joensen UN，Bossi R，Leffersh，etal.Do perfluoroalkyl compoundsimpairhuman semen quality?[J].Environhealth Perspect，2009，117(6)：923-927.

[5] Toft G，Jonsson BA，Lindh CH，etal.Exposure to perfluorinated compounds andhuman semen quality in Arctic and European populations[J].Hum Reprod，2012，27(8)：2532-2540.

[6] Specht IO，Hougaard KS，Spanom，etal.Sperm DNA integrity in relation to exposure to environmental perfluoroalkyl substances-a study of spouses of pregnant women in three geographical regions[J].Reprod Toxicol，2012，33(4)：577-583.

[7] Vested A，Ramlau-Hansen CH，Olsen SF，etal.Associations of in utero exposure to perfluorinated alkyl acids withhuman semen quality and reproductivehormonesin adultmen[J].Environhealth Perspect，2013，121(4)：453-458.

[8] Louis GM，Chen Z，Schisterman EF，etal.Perfluorochemicals andhuman semen quality：the LIFE study[J].Environhealth Perspect，2015，123(1)：57-63.

[9] 李洪志，刘洁婷，张春雷，等.PFOS青春期暴露对成年期雄性大鼠的生殖毒性[J].生 态毒理学报，2012(4)：434-438.[10] 范轶欧，金一和，麻懿馨，等.全氟辛烷磺酸对雄性大鼠生精功能的影响[J].卫 生研究，2005(1)：37-39.

[11] Cheng CY，WongeW，Lie PP，etal.Environmental toxicants andmale reproductive function[J].Spermatogenesis，2011，1(1)：2-13.

[12] Qiu L，Zhang X，Zhang X，etal.Sertoli cell is a potential target for perfluorooctane sulfonate-induced reproductive dysfunction inmalemice[J].Toxicol Sci，2013，135(1)：229-240.

[13] Lopez-Doval S，Salgado R，Pereiro N，etal.Perfluorooctane sulfonate effects on the reproductive axisin adultmale rats[J].Environ Res，2014，134：158-168.

[14] 马英，杨春壮，刘星，等.妊娠期染毒PFOS对子代成年雄鼠生殖毒性作用及机制探讨[J].四川大学学报(医学版)，2015(4)：564-567.

[15] 文永霞，马文智，刘香，等.全氟辛烷磺酸新生发育期胁迫致雌性大鼠成年期生育能力下降和子代不育[J].职业与健康，2015(24)：3399-3402.

[16] Lee YJ，KimmK，Bae J，etal.Concentrations of perfluoroalkyl compoundsinmaternal and umbilical cord sera and birth outcomesin Korea[J].Chemosphere，2013，90(5)：1603-1609.

[17] 刘静.孕期暴露三氯生对秀丽线虫子代运动、生殖的影响[D].新 乡：新乡医学院，2014.

[18] 杨栋，刘冉，董自平，等.壬基酚对秀丽隐杆线虫的生殖毒性[J].环 境与健康杂志，2014(6)：473-476.

Reproductive toxicity of perfluorooctane sulfonate and perfluorooctanoic acid on Caenorhabditis elegans

JIAN Zihai，DAI Shuhao，WANG Xuefei，YANG Zijie，LU Qiang，YANG Zhenglong，AWUYING·Hadelebieke，YIN Lihong，LIU Ran*
(Key Laboratory of Environmentalmedicine Engineering,ministry of Education, School of Publichealth, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu, China)

目的： 探讨全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)对秀丽隐杆线虫的生殖毒性，寻找评价PFOS和PFOA生殖毒性的替代模型。方法：PFOS和PFOA分别设高、中、低3个染毒剂量(0.1、0.01、0.001mmol/L)组和空白对照组，同步化后L4期幼虫在24孔板里染毒24h，L1期幼虫染毒48h，测定后代数目和世代时间。结果：L4期幼虫染毒24h后，与对照组比较，PFOS高、中剂量组后代数目差异具有统计学意义(P<0.05)，PFOA的3个剂量组后代数目差异均有统计学意义(P<0.05)；PFOS和PFOA各剂量组世代时间差异均无统计学意义(P>0.05)。L1期幼虫染毒48h后，与对照组比较，PFOS和PFOA高、中剂量组后代数目差异具有统计学意义(P<0.05)；PFOS 3个剂量组的世代时间差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论：后代数目是PFOS和PFOA生殖毒性的敏感指标，L1期幼虫的世代时间对PFOS暴露比L4期幼虫更敏感，但PFOA不影响线虫的世代时间。线虫可能成为评价PFOS和PFOA生殖毒性的替代模型。

全氟辛烷磺酸；全氟辛酸；秀丽隐杆线虫；后代数目；世代时间

OBJECTIVE:Caenorhabditis elegans were used to investigate the inductionof reproductive toxicity of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoic acid (PFOA)，as an alternativemodels for evaluating reproductive toxicity.METHODS：Three PFOS/PFOA dose (0.1，0.01，0.001mmol/L) groups and a control group were organized.After synchronization，L4 larvae were exposed for 24h in 24-well plates，the L1 larvae were exposed for 48h.The brood size and the generation time of Caenorhabditis elegans were evaluated to determine the inductionof reproductive toxicity by PFOS and PFOA.RESULTS：Compared with the control，thehigh and themedium dose groups with exposure for 24h showed significant difference in the brood size (P<0.05)，and the three PFOA exposure dose groups showed significant difference among them (P<0.05).Generation time showed no significant difference among the exposed and the control groups.Compared with the control group，thehigh andmedium dose groups with exposure for 48h showed significant difference in the brood size (P<0.05) and the three exposed groups showed significant difference in generation time (P<0.05).CONCLUSION：The results suggested that brood size of Caenorhabditis elegans was a sensitive indicator for evaluating reproductive toxicity of PFOS and PFOA.In addition，generation timemeasurements wasmore sensitive using L1 larvae than thatof L4 larvae.

PFOS；PFOA；Caenorhabditis elegans；brood size；generation time

R994.6

A

1004-616X(2016)06-0484-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.015

2016-08-28；

2016-10-13

国家自然科学基金(81273123)

作者信息： 简子海，E-mail：674530636@qq.com。*通信作者：刘 冉，E-mail：ranliu@seu.edu.cn