学龄儿童奶粉中添加食源性生物活性肽对免疫调节作用的影响

尹 曼，王一侠，唐秉华，陈丽萍，谷瑞增，蔡木易，魏 颖

(1中国食品发酵工业研究院，北京 100015；2北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京 100015；3宏乐集团有限公司，广州 510000)



学龄儿童奶粉中添加食源性生物活性肽对免疫调节作用的影响

尹 曼1，2，王一侠1，2，唐秉华3，陈丽萍3，谷瑞增1，2，蔡木易1，2，魏 颖1，2

(1中国食品发酵工业研究院，北京 100015；2北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京 100015；3宏乐集团有限公司，广州 510000)

应用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导小鼠腹腔巨噬细胞，检测其中性红吞噬能力和NO释放量，应用刀豆蛋白A(Concanavalin A，Con A)和LPS诱导小鼠T/B淋巴细胞检测其增殖能力，通过与4种常见市售学龄儿童奶粉的免疫调节能力作比较，评价学龄儿童奶粉中添加食源性生物活性肽对的免疫调节能力。结果表明：学龄儿童奶粉中添加食源性生物活性肽对能够提高腹腔巨噬细胞的吞噬能力、NO释放量和淋巴细胞的增殖能力，说明添加食源性生物活性肽的学龄儿童奶粉具有较好的增强免疫的功能。

学龄儿童奶粉；免疫调节；腹腔巨噬细胞；脾淋巴细胞

学龄儿童处于生长发育的突增高峰期，必须供给足够的蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质、维生素等营养素，其中奶类是蛋白质和矿物质的重要来源。学龄儿童奶粉主要包括牛乳、乳清蛋白、聚葡萄糖、低聚半乳糖、牛磺酸、维生素和矿物质等，保证学龄儿童能够及时补充生长所需的各类营养物质。乳清蛋白易于消化吸收，在提供优质蛋白的同时具有清除体内自由基、抑菌防癌，其含有较高谷氨酸，能够保证免疫细胞的功能[1，2]；脂肪酸主要指不饱和脂肪酸，在补充学龄儿童生长所需大量能量的同时有助于儿童大脑发育并对自闭症、多动症学习能力障碍等有一定缓解作用[3]，还可调节免疫、脂肪和血糖血脂的代谢[4]；低聚糖中聚葡萄糖在保证产品稳定性的同时兼具益生功效[5]，低聚半乳糖作为母乳中的重要的双歧因子，可以促进胃肠道的消化，调节肠道菌群的平衡[6]；牛磺酸作为体内必需的一种氨基酸，与神经系统的发育密切相关，调节机体正常的生理活动，并发挥多种益生功效[7]；微量元素的补充主要来自饮食，是体内多种酶的关键组成部分，与机体的免疫功能及体格智力发育等关系密切[8]。

学龄期儿童的免疫系统发育尚未成熟，补充足够的营养物质对其生长发育具有重要的促进和保障作用。目前已研究的免疫增强剂主要包括微生物类、生物因子类、人工合成类、微量元素类以及天然类药物[9]，微量元素主要为矿物质和维生素；其中我国已将维生素和矿物质作为营养补充剂，可以维生素和矿物质为原料，制备儿童增免类营养补充剂[10]。近年来，随着易吸收食源性生物活性肽的研究与发展，其免疫调节等功能越来越引起关注，有大量研究表明，大豆肽、小麦肽、酪蛋白肽等均具有刺激机体淋巴细胞的增殖、NK细胞的活性、释放免疫因子等增强机体免疫功能的功效[11-13]。

配合其他营养素，希望能够增强学龄儿童的免疫调节能力。本实验从腹腔巨噬细胞吞噬能力和脾淋巴细胞转化率入手，探讨添加易于人体胃肠道吸收的食源性生物活性肽的学龄儿童奶粉对免疫调节的影响，通过与4种常见市售奶粉作对比，评价自制学龄儿童奶粉的免疫调节功能，为后期奶粉配方的调整提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4种市售学龄儿童奶粉：购于超市，主要含牛乳、脂肪酸、低聚糖、牛磺酸、维生素和矿物质；添加FDBP学龄儿童奶粉：自制产品。小鼠(Balb/c，6～8w龄)，北京维通利华实验动物技术有限公司；刀豆蛋白A、脂多糖、MTT，Sigma公司；RPMI-1640培养基，Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、青霉素链霉素溶液(双抗)，四季青公司；红细胞裂解液、CCK-8、缓冲液PBS、Griess试剂，碧云天生物技术研究所；DMSO，西陇化工股份有限公司；中性红，Amresco公司。

1.2 仪器与设备

1.3 试验方法

1.3.1 基础理化分析 蛋白质含量的测定[16]采用国际GB/T 22492—2008《大豆肽粉》测定。水分含量的测定[17]采用国际GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》测定学龄儿童奶粉中水分含量。

1.3.2 学龄儿童奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞的影响

(1)小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备：制备方法参考文献[14]。小鼠腹腔注射1.5 mL 4 %肉汤淀粉溶液，诱导3d后拉颈处死，无菌收集腹腔液，离心收集细胞，流式细胞仪计数，用RPMI-1640完全培养液(含10 %胎牛血清、1%双抗)调整细胞密度为1×106个/mL，100μL /孔加入96 孔细胞培养板中，于二氧化碳培养箱中培养 2.5 h，制备96 孔板巨噬细胞单层。

(2)学龄儿童奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响：将细胞分为空白对照组和实验组，实验组加入奶粉样品，于二氧化碳培养箱内培养24 h，弃上清，PBS洗2 次，加入MTT溶液100μL，继续培养4h，弃上清，加入DMSO 100 μL，震荡使溶解，用酶标仪测定OD490nm值。增殖率计算公式如(1)式：

(1)

(3)学龄儿童奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的测定：将细胞分为空白对照组、模型组和实验组，模型组加入LPS(终浓度30 μg/mL)，试验组分为2 种，即LPS与奶粉共同作用组和奶粉单独添加组。每组各设6 个复孔，于二氧化碳培养箱内培养24 h。之后，洗涤细胞2 次，每孔加入100 μL 0.1 %中性红溶液，于二氧化碳培养箱内继续培养1 h，弃上清，每孔加入100 μL细胞溶解液[含体积分数1 %乙酸的50 %(体积分数)乙醇溶液]，室温放置2 h，待细胞溶解后，酶标仪测定OD550nm值。吞噬指数(Pinocytosis index，PI)计算如(2)、(3)式：

俄罗斯认为俄罗斯是欧洲的俄罗斯，但是却注定漂泊。横跨欧亚的国土和以前蛮荒的历史让他之于亚洲、欧洲仿佛是禽鸟、野兽之间的蝙蝠。纵使它历史绵长，自认承拜占庭之正统；纵使它幅员辽阔，坐拥世界上最大的版图。

(2)

(3)

(4)学龄儿童奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞NO生成量的测定：小鼠腹腔巨噬细胞经样品干预24 h后，取各孔培养上清液，Griess法检测细胞NO生成量。

1.3.3 学龄儿童奶粉对T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖的影响

(1)小鼠脾细胞悬液的制备：制备方法参考文献[15]。将小鼠拉颈处死，无菌取脾脏研磨，离心，收集细胞，用RPMI-1640完全培养基重悬。流式细胞仪调整细胞浓度。

(2)学龄儿童奶粉对脾淋巴细胞增殖的影响：将调整好细胞浓度的脾细胞悬液(2.25×106个细胞/mL)90 μL/孔接入到96 孔板中，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组加入奶粉样品，于二氧化碳培养箱内培养24 h，加入CCK-8继续培养4h，用酶标仪测定OD450nm值，按(1)式计算细胞增殖率。

(3)学龄儿童奶粉对B淋巴和T淋巴细胞增殖的影响：将调整好细胞浓度的脾细胞悬液(2.5×106个细胞/mL)80 μL/孔接入到96 孔板中，添加 ConA/LPS(LPS终浓度5 μg/mL、ConA终浓度10 μg/mL)、设置模型组，ConA/LPS、不同浓度的样品溶液设置样品组，20不完全培养基为空白对照组，每组4个复孔，将培养板置于二氧化碳培养箱中培养72 h。CCK-8法测定细胞增殖率，结果用刺激指数(Stimulation index，SI)表示T/B淋巴细胞增殖的结果，计算如(4)、(5)式：

(4)

(5)

1.4 统计学处理

2 结果与分析

2.1 学龄儿童奶粉基础理化性质分析

学龄儿童奶粉中总蛋白含量占27.96%±0.08%，其中酸溶蛋白即包括肽及氨基酸等较低分子量的蛋白水解物占6.916%±0.721%，极显著高于4种市售奶粉(附表)，说明自制奶粉中含有较高含量的生物活性肽，更易于学龄儿童的吸收，补充生长发育所需的蛋白质。

2.2 学龄儿童奶粉对腹腔巨噬细胞的影响

巨噬细胞属于机体固有免疫细胞，在非特异免疫反应和特异性免疫反应中起着关键作用，巨噬细胞具有可塑性，受到不同抗原刺激会分化为不同类型的巨噬细胞，起到促进或抑制炎症反应的发生。经典的巨噬细胞的激活方式是受LPS、干扰素-γ(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF)的激活，巨噬细胞会增加细胞毒性物质NO和活性氧中间体的释放，清除细胞内的病原体[16]。本实验通过LPS诱导腹腔巨噬细胞，通过细胞对中性红的吞噬能力和NO释放量的检测结果，来评价自制奶粉和常见市售奶粉的免疫调节能力。在3个样品浓度下5种奶粉均能极显著的促进正常腹腔巨噬细胞的增殖(P<0.01)，说明几种奶粉均有很好的增强免疫的能力，具体可通过LPS诱导的巨噬细胞中性红吞噬能力和NO释放量来进一步表现出来(图1)。

附表 学龄儿童奶粉基础理化成分含量 单位：%

图1 学龄儿童奶粉对小鼠正常腹腔巨噬细胞增殖的影响

对正常腹腔巨噬细胞而言，3 个浓度的5 种奶粉均能提高其吞噬中性红的能力，自制奶粉组的PI检测结果呈“倒U”型，在400 μg/mL时达到最大PI值，并优于其他几种市售奶粉组，在200 μg/mL时优于奶粉4，在800 μg/mL时优于奶粉1和奶粉3；对LPS诱导的腹腔巨噬细胞的吞噬能力，几种奶粉并没有表现出很好的增强作用，自制奶粉能够提高LPS诱导的腹腔巨噬细胞的吞噬能力，但相比于模型组而言并没有统计学意义上的差异，在200、400 μg/mL时优于奶粉3，在800 μg/mL时优于奶粉2、奶粉3和奶粉4(图2、图3)。

图2 学龄儿童奶粉对小鼠正常腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

图3 学龄儿童奶粉对LPS诱导的腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响

3个浓度下5种奶粉均能促进LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO的释放，且促进NO释放的能力与样品浓度正相关。在400、800 μg/mL时自制奶粉能够极显著的促进LPS诱导的腹腔巨噬细胞释放NO(P<0.01)，并与奶粉3相当(图4)。

图4 学龄儿童奶粉对LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO释放量的影响

综合腹腔巨噬细胞中性红吞噬能力和NO释放量检测结果，添加FDBP学龄儿童奶粉对腹腔巨噬细胞的吞噬能力具有一定的增强作用，奶粉4相对来说对腹腔巨噬细胞的作用效果最好，奶粉4含有相对较高含量的铁、锌，丰富的维生素和牛磺酸；而矿物质、维生素作为营养补充剂可以增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力及T/B淋巴细胞的增殖能力和CD4/CD8的比值[17，18]，同时，牛磺酸可通过增强免疫细胞的抗氧化能力来增强机体免疫[19]，此结果说明，较高含量的矿物质、维生素以及较高含量的牛磺酸对增强免疫力有一定影响，可作为后期奶粉配方调整的依据。

2.3 学龄儿童奶粉对脾淋巴细胞增殖的影响

脾脏在特异性免疫反应中具有重要的作用，其中B淋巴细胞的转化能力是反映机体体液免疫的重要方法、T淋巴细胞的转化能力是反映机体细胞免疫的重要方法。LPS可以通过Toll样受体4(TLR4)和另一种Toll样受体蛋白RP105的表达直接促进B淋巴细胞的分化成熟[20]；Con A可以通过促进T淋巴细胞活化过程中重要信号转导膜分子CD3ε以及相关趋化因子的表达来促进T淋巴细胞的活化[21]。本实验采用LPS和ConA对提取的脾淋巴细胞进行诱导，通过MTT增殖实验来判断奶粉对T-/B-淋巴细胞增殖的影响，评价自制学龄儿童奶粉和市售奶粉的免疫调节功能。

由图5可看出，3个浓度的5 种奶粉均能极显著的促进正常脾淋巴细胞的增殖(P<0.01)，且促进增殖的能力与样品浓度正相关。在200 μg/mL时自制奶粉组促进脾淋巴细胞增殖的能力高于其他几种市售奶粉，在400、800 μg/mL时的促进增殖能力仅低于奶粉2。

图5 学龄儿童奶粉对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

学龄儿童奶粉对LPS诱导的小鼠B淋巴增殖的影响结果见图6。由图6可看出，3 个浓度下5 种奶粉均能促进LPS诱导的B淋巴细胞的增殖。自制奶粉组在3个浓度下对B淋巴细胞增殖的能力相差不大，与奶粉4相当，且均优于奶粉2。由图7可看出，3 个浓度下5 种奶粉均能促进ConA诱导的T淋巴细胞的增殖，且促进增殖的能力与样品浓度正相关，这与奶粉对脾淋巴细胞增殖的实验结果相一致，说明这几种奶粉具有很好的促进T淋巴细胞增殖的能力。在200 μg/mL时自制奶粉促进T淋巴细胞增殖的能力与奶粉2相当，在400 μg/mL时优于奶粉3并与其他几种奶粉，在800 μg/mL时的促增殖能力要远高于其他几种市售奶粉。

图6 学龄儿童奶粉对LPS诱导的B淋巴细胞增殖的影响

图7 学龄儿童奶粉对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响

综合脾淋巴细胞转化实验结果，添加FDBP学龄儿童奶粉可促进T、B淋巴细胞的增殖，在800μg/mL时既能显著促进B淋巴细胞增殖(P<0.05)又能极显著促进T淋巴细胞增殖(P<0.01)，且至少优于1种奶粉对学龄儿童来说，优质的蛋白对其生长发育、认知能力和免疫功能是必需的[22]，生物活性肽易于人体吸收，在供给儿童生长发育所需蛋白质和氨基酸的同时，可发挥其生理功效，将其添加到营养辅食中，对学龄儿童的生长发育具有一定促进作用。

3 结论

对自制研发学龄儿童奶粉的免疫调节能力进行了研究，结果表明：对经LPS诱导和正常的小鼠腹腔巨噬细胞，自制奶粉均能提高其中性红吞噬能力，促进LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO的释放，并极显著促进腹腔巨噬细胞的增殖(P<0.01)；自制奶粉对 ConA和LPS 诱导的小鼠T和B淋巴细胞增殖均有促进作用，并极显著的促进脾淋巴细胞的增殖(P<0.01)，说明自制学龄儿童奶粉具有较好的增强免疫的功效。与其他4种市售奶粉相比，除了LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO释放量外，其他检测指标都至少优于一种奶粉，这可能与其小分子生物活性肽有关。

生物活性肽由于易于吸收且具有一定的功效性，可作为优质蛋白，同时作为营养补充剂的微量元素的加入，可协同增强产品的功效。本次实验为后期奶粉配方的调整提供一定的实验依据。相关增免奶粉的专利中包括维生素与矿物质的配[23]比，胡萝卜素和多不饱和脂肪酸的配比[24]以及从调节肠道菌群入手的复合益生元的配比等，这些均为配方的优化提供一定参考，进一步去提高产品的功效。◇

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(责任编辑 李婷婷)

Effect of School-age Children Milk Powder Added with Food Borne Bioactive Peptides on Immunoregulation in Vitro

YIN Man1，2，WANG Yi-xia1，2，TANG Bing-hua3，CHEN Li-ping3，GU Rui-zeng1，2，CAI Mu-yi1，2，WEI Ying1，2

(1Beijing Engineering Research Center of Protein & Functional Peptides，Beijing 100015，China；2China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China；3Wineer Wells Group Limited，Guangzhou 510000，China)

Totally three kinds of school-age children milk powder selected from market，the other one added with food borme bioactive peptides lab were selected as samples.The effect of school-age children milk powder on the proliferation of murine splenocytes was detected by WST-8.The effects of school-age children milk powder on phagocytic activity and the NO production by macrophages were studied in order to evaluate the cell viability of mouse peritoneal.Results showed that the school-age children milk powder added with food borne bioactive peptides had the better immunoregulationon effect，indicating that the milk powder added with food borme bioactive peptides had good immune-modulation.

school-age children milk powder；immunoregulation；macrophages；splenocytes

十三五国家重点研发计划(项目编号：2016YFD0400604)；国家高技术研究发展计划(863计划)项目(项目编号：2013AA102205-02)。

尹曼(1991— )，女，硕士，研究方向：食品营养。

魏颖(1981— )，女，博士，高级工程师，研究方向：功能食品。