数字成型脱矿皮质骨组织工程学半月板支架的制备与检测

谢兴 朱敬先 胡小青 敖英芳

北京大学第三医院运动医学研究所（北京 100091）

数字成型脱矿皮质骨组织工程学半月板支架的制备与检测

谢兴 朱敬先 胡小青 敖英芳

北京大学第三医院运动医学研究所（北京 100091）

目的：探寻新的异种异体半月板移植物。方法：使用牛胫骨皮质骨板作为移植物原料，通过测量实验动物的实际膝关节半月板数据，经过三维建模重建半月板形态，利用数控机床对脱钙皮质骨进行加工。对加工成型的半月板进行生物力学检测，同时观察其大体结构及超微结构。结果：该方法制备的异种异体半月板移植物能够很好地进行塑形改建，具有接近正常猪半月板的生物力学性质。同时含有大量I型胶原网络，利于新生组织长入及替代。该移植物有细胞长入的空隙，同时具有一定的初始支撑强度。结论：该移植物具有细胞长入的空隙，同时具有一定的初始支撑强度，可作为半月板的替代材料。

半月板移植；脱钙皮质骨；数字成型；组织工程半月板

半月板损伤是常见的运动创伤。虽然对于半月板损伤的治疗原则已从起初的全切半月板发展到现在的尽量多地保留半月板[1]，但很多严重损伤如盘状软骨撕裂，位于非血供丰富区的严重撕裂的半月板往往还免不了要接受半月板全切除手术。半月板全切术后将导致过早的、进行性的关节软骨退变。将同种异体半月板移植引入临床可解决半月板缺失后的膝关节退变问题，但同种异体半月板移植的供体来源非常有限，且存在与受体的匹配问题。因此，人们不断探索新的半月板移植物。理想的半月板移植物除了具备与同种异体半月板相同或相近的生物力学特性外，还需要具备易于获得且具有一定的可塑性。

异种异体半月板移植作为同种异体半月板移植的替代曾在本所进行了初步的实验研究，经过对移植物的不断改善，结果表明，异种异体半月板组织移植后对软骨有保护作用，可以延迟关节软骨的退变[2]。但异种异体半月板移植物取材后不易进行修整，难以使其与受体完美结合，鉴于此，本研究旨在寻找新的可进行塑形的移植物。

1 材料和方法

1.1 受体半月板的测量

准确地测量受体半月板的数据是能否准确修整半月板移植物的关键。在研究过程中我们曾经考虑对动物进行个体测量然后个性化进行假体制作，如果每只动物都进行CT及MRI，需要对每只动物进行麻醉，工作量巨大，且无法在短时间内完成。我们选择了替代方案。取用其他实验剩余的猪内侧半月板采集数据进行比较，选择体重相近的猪龄为1年左右的实验用猪进行测量，寻找出一种移植物的模板，使得所有被测动物的半月板与模板相比误差均小于10%。分别计算半月板体部及前后角的长、宽、厚度，记录、制作表格，然后将测量数据求均值，作为建立半月板数字模型的数据基础。

1.2 受体半月板的数字三维重建

将测量的数值代入设计好的半月板三维重建数字模型，构建数字化的三维半月板模型，模型设计的原理是假设半月板胫骨面为水平，扫描半月板股骨面建立半月板股骨面弧面，然后使其与水平面连接形成半月板形态，不连续的部位用垂线作图将其连接。为手术方便，我们还设计了半月板假体的连接柄以便将半月板插入骨道内。所有建模过程均使用UG NX4 CAD软件。见图1。

图1 半月板三维重建数字模型

1.3 脱矿皮质骨的准备及成型

选择皮质骨均匀的牛胫骨皮质骨，将其切割成为长方形片状，进行脱钙。使用快速脱钙液（中杉金桥）浸泡样本24小时，然后经流水冲洗，洗去多余的脱钙液。使用精细化数控机床（Carver S600A RT北京精雕）将其塑形成为预计的半月板移植物。将脱钙后的标本进行冷冻干燥，使用冷冻干燥机冷冻干燥48小时。冷冻干燥后的标本深低温（－80℃）保存，使用前用生理盐水浸泡半小时以上进行水合。见图2。

图2 皮质骨支架制作过程

1.4 超微结构观察

取一块水合后的脱钙骨标本，投入戊二醛固定液再次固定24小时以上。经充分固定后，在与固定液相同的磷酸缓冲液中浸洗3次，充分洗去固定液成分。分别切取冠状面及横断面。切好的组织逐级酒精脱水，临界点干燥，导电处理后包埋在金属托上，使用扫描电镜（JEOL公司JSM-5600LV）进行观察。电镜下随机选取胶原暴露清晰的视野，进行拍照，图像用photoshop软件进行分析。

1.5 生物力学性质分析

使用纳米压痕测试仪器（TI950 Tribolndenter HYSITRON）对水合前及水合后的脱钙骨及正常小型猪半月板组织分别进行测试。测试方法如下。

取脱矿皮质骨支架和小型猪半月板组织，切割成肉眼可见的平整的小块。10%中性甲醛固定1 h，流水洗去固定液；将样品固定在纳米压痕测试托柄上，PBS溶液保持样品湿润；选用直径20 μm球状蓝宝石探头，压缩臂选用TriboIndenter；压缩条件设定为：加载2 s，保持2s，卸载2 s；最大压痕深度为500 nm；通过视频监控选定测试点，取五点平均值为修复组织的力学特性。微观扫描：利用纳米压痕仪器微观探头，对软骨缺损修复进行微观扫描，获取修复组织的微观形貌图，分析修复关节面的平整度。数据处理：纳米压痕过程中数据的收集包括负荷与压痕深度，频率为50 Hz，初步获得样品的负荷-位移曲线。

2 结果

2.1 受体半月板测量数据

测量15只猪半月板的前后径、左右径、前角宽、体部宽、后角宽、胫骨平台前后径、胫骨平台左右径、前角厚、体部厚、后角厚。计算其平均值。

表1 小型猪半月板及胫骨平台测量数据（±s，cm，n=15）

表1 小型猪半月板及胫骨平台测量数据（±s，cm，n=15）

部位 测量值2.80–0.10 2.71–0.11 1.1–0.08 0.95–0.04 1.21–0.08 0.65–0.04 0.61–0.05 0.63–0.06 3.05–0.14 2.84–0.11前后径左右径前角宽体部宽后角宽前角厚体部厚后角厚胫骨平台前后径胫骨平台左右径

2.2 脱钙骨的超微结构

经过扫描电镜观察，脱钙骨放大后呈现网格状的胶原网络，表面结构凹凸不平，利于细胞的粘附（图3A）。在进一步放大后，可以观察到由于脱钙，皮质骨表面有大小不一的孔洞，可以自由通过小分子蛋白质等，利于物质交换（图3B）。

图3 脱钙骨支架的扫描电镜观察

2.3 纳米压痕仪器测量脱钙骨支架的生物力学性能

通过纳米压痕仪器对水合前、后组织工程半月板支架和正常小型猪半月板组织进行压力测试，结果可见水合前脱矿皮质骨生物力学特性接近骨组织，水合后与半月板组织接近。见图4。

图4 水合前后的半月板支架材料负荷-位移曲线

3 讨论

移植物的可塑性是移植物与受体完美匹配的关键因素，与移植成功与否息息相关。即便是同身高体重的人之间，半月板形状也会存在很大差异，而半月板移植物允许的误差为10%。对移植物进行一定的修整可以提高移植的成功率。在本实验中，我们挑选特殊部位的皮质骨牛胫骨的皮质骨板作为支架的材料，这几乎是牛四肢长骨中强度最大、形状最为规整、密度最大的部位。用它来进行加工，能满足我们对材料尺寸及生物力学性能的要求。另外，精确建模及数字三维重建是我们控制移植物形状的方法。这种方法也被应用于血管及骨组织等多种组织器官的移植中[3，4]。实验结果表明，此方法获取的半月板移植物形态与自体半月板匹配度高，可以用于进一步的移植实验。

为了进一步分析移植物支架的生物学特性，我们对其结构进行了分析。脱矿皮质骨主要构成为I型胶原，与半月板相似，我们观察其超微结构特点，发现其胶原纤维的排列有足够的孔隙让细胞长入。而脱钙处理过程可以有效地去除组织中残余的细胞成分，大大降低异种移植物的抗原性。本实验中脱矿皮质骨在塑形前进行了脱钙脱脂深低温冷冻等步骤，这些去抗原性的步骤将植入物抗原性降到了最低水平。脱矿骨组织在体内有骨化的可能，在植入前可进行因子诱导其成软骨，以防止其骨化导致植入手术失败。在后续动物实验中，我们将对牛皮质骨板制作的半月板移植物进行进一步免疫学检测。

我们之前的研究以及其他学者的研究[5，6]，均发现脱钙皮质骨具有很好的生物相容性，可以让组织细胞快速长入。这也是该材料能够作为组织工程支架的理论基础。而力学特性是决定半月板移植成功与否的关键因素。我们在研究中使用纳米压痕技术对牛脱矿皮质骨的生物力学特性进行了检测。该技术的精确测量程度达到了纳米级[7]，可以对类似软骨的组织进行很好的检测与分析[8，9]。本实验结果表明水合后的皮质骨支架更接近于半月板组织自身的力学强度，其压力-应变曲线更加光滑，说明其表面更为规则。由于含水量对标本力学性质的影响主要表现在对蠕变性能的影响上，对于软骨类组织，这一指标就显得尤为重要。在其他学者的研究中也对比了不同含水量对材料弹性模量的影响[10]，与我们的研究结果相符。同时，经过水合处理的半月板支架可以更好的加工，其表面更易于进行生物修饰。

4 总结

通过对小型猪半月板的精细测量，我们建立了重建移植物的三维模型。利用精细加工数控机床，我们使用脱钙后的牛皮质骨板制备了半月板异种异体移植物。制作出的模型可重复性高，形态规则，与半月板高度匹配。通过对移植物的超微结构观察及使用纳米压痕仪对其生物力学性能进行测试，结果证实该移植物具有细胞长入的空隙，同时具有一定的初始支撑强度，可作为半月板的替代材料。

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[8]刘志远，杨庆生.基于纳米压痕法的关节软骨保湿测量技术.医用生物力学，2011，5：408-412.

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[10]刘志远，杨庆，李熙.软骨含水量对其纳米硬度及动态纳米力学性能的影响.力学与工程应用，2012，8：202-205.

Digital Prototyping Demineralized Bone Tissue Scaffold for Meniscal Implantation

Xie Xing，Zhu Jingxian，Hu Xiaoqing，Ao Yingfang
Institute of Sports Medicine，Third Hospital of Peking University，Beijing，China 100191 Corresponding Author：Ao Yingfang，Email：yingfang.ao@vip.sina.com

Objective To introduce an alternative xenogenic subject for meniscal implantation.Methods The bovine tibial cortical bone was decalcified using the CNC machine and then reconstructed to be the shape of swine knee meniscus through the three-dimensional modeling.The biomechanics，general structure and ultrastructure of the mimic xenogenic meniscus were observed.Results The xenogenic meniscal grafts exhibits the biomechanical property similar to the swine meniscus and contains a large number of type I collagen matrix，which provides enough space for new cell growing and filling.The reconstructed graft also has better initial biomechanical strength.Conclusion The xenogenic graft processed from bovine tibial cortical bone can be used as an alternative material for meniscal implantation due to its adequate cell growing gap and better initial support strength.

meniscal transplantation，decalcified cortical bone，digital prototyping，tissue engineering

2015.12.18

国家自然科学基金（项目批准号81401810）

敖英芳，Email：Email：yingfang.ao@vip.sina.com