β-胡萝卜素对食管癌细胞凋亡与Cav-1表达的影响*

朱相展，张彦婷，韩 康，李庆华，张楠楠，马珊珊，张 琨，关方霞1,#

1)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院 郑州 450052



β-胡萝卜素对食管癌细胞凋亡与Cav-1表达的影响*

朱相展1)，张彦婷1)，韩 康1)，李庆华1)，张楠楠2)，马珊珊1)，张 琨1)，关方霞1,2)#

1)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院 郑州 450052

#通信作者，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物医学，E-mail：guanfangxia@126.com

β-胡萝卜素；食管癌；小窝蛋白-1；细胞凋亡；TE1；EC1；Eca109

目的：观察β-胡萝卜素对食管癌细胞凋亡的影响，并分析食管癌细胞对β-胡萝卜素的敏感性与小窝蛋白-1(Cav-1)表达的关系。方法：采用Western blot法检测正常食管上皮细胞株Het-1A及食管癌细胞(TE1、EC1和Eca109)中Cav-1蛋白的表达；CCK-8法检测不同浓度(0、1、5、10、20、30、50 μmol/L)β-胡萝卜素处理食管癌细胞12、24、36、48、60、72 h后，对食管癌细胞增殖抑制的影响，筛选出β-胡萝卜素的最佳处理时间及浓度；在筛选条件下处理食管癌细胞，采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率；qRT-PCR检测Cav-1 mRNA表达水平的变化；Western blot检测Cav-1蛋白表达水平的变化。结果：Cav-1蛋白在食管癌细胞中呈过表达(TE1>Eca109>EC1)，而Het-1A细胞中无Cav-1表达。β-胡萝卜素对正常食管上皮细胞的增殖无抑制作用，而对食管癌细胞(TE1、EC1和Eca109)的增殖抑制作用具有时间和剂量依赖性，且食管癌细胞对β-胡萝卜素的敏感性与Cav-1的表达有关。分别采用30、50、50 μmol/L β-胡萝卜素处理48 h后，TE1、Eca109和EC1细胞凋亡率显著提高(P<0.05)，Cav-1 mRNA和蛋白质表达水平均明显下降。结论：β-胡萝卜素能够有效促进食管癌细胞凋亡，而对正常食管上皮细胞无毒性作用，且食管癌细胞对β-胡萝卜素的敏感性可能受到Cav-1的调节。

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。我国食管癌发病率有明显的地区差异性，在太行山南部三省交界处尤为高发，其中河南林州食管癌发病率占当地总恶性肿瘤的80%以上[1]。由于食管癌早期症状不明显，临床患者诊治时大多为中晚期，预后效果差，5 a生存率不足10%[2]。虽然经过多年的研究，目前针对食管癌仍没有切实可行的治疗方法，食管癌患者的生存率并没有得到根本的改善，因此寻找行之有效的干扰食管癌发生和发展的物质成为研究的重要方向。β-胡萝卜素是一种广泛存在于绿色植物中的共轭双烯烃化合物。研究[3-5]表明β-胡萝卜素可以抑制胃癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌等多种肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。Palozza等[6]研究发现，β-胡萝卜素对结肠癌细胞和前列腺癌细胞的增殖抑制作用与小窝蛋白(caveolin-1，Cav-1)的表达量呈正相关。小窝是细胞质膜凹陷形成的囊状结构，它参与细胞的物质运输和信号转导，其主要结构蛋白Cav-1在肿瘤增殖、分化和凋亡的过程中发挥着重要作用，并且Cav-1在多种恶性肿瘤中异常表达[7]。该研究旨在探讨β-胡萝卜素对食管癌细胞增殖与凋亡的影响，并通过观察该过程中Cav-1表达量的变化情况，分析β-胡萝卜素抑制食管癌细胞增殖与Cav-1的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 正常食管上皮细胞Het-1A及食管癌细胞株TE1、EC1、Eca109由郑州大学第一附属医院细胞生物学实验室保存，β-胡萝卜素(美国Sigma公司)，RPMI 1640培养基及胰蛋白酶(北京索来宝公司)，标准胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)，四氢呋喃(美国Sigma公司)，Transwell小室(美国Corning公司)，结晶紫染色液(北京碧云天公司)，Cav-1单克隆抗体(美国CST公司)，GAPDH多克隆抗体[生工生物工程(上海)有限公司]，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)。CCK-8试剂盒(日本同仁)，细胞全蛋白提取试剂盒[生工生物工程(上海)有限公司]，RNA提取试剂盒 (英迈捷生物科技有限公司)，RNA逆转录试剂盒(大连TaKaRa公司)，SYBR Premix Ex TaqⅡ染料法荧光定量试剂盒(德国QIAGEN)。β-胡萝卜素溶解于四氢呋喃配制成10 mmol/L母液，现用现配。

1.2 细胞培养 细胞使用含体积分数10% FBS的RPMI 1640培养基于37 ℃，体积分数5% CO2培养箱内培养，2 d传代1次。实验时将细胞接种于培养板中，待细胞生长至对数生长期后用于后续实验。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖情况 收集细胞并调整细胞浓度至4×104mL-1，接种于96孔板中，每孔约4×103个细胞。细胞贴壁24 h后，分别加入0、1、5、10、20、30、50 μmol/L的β-胡萝卜素作为实验组，并设定阴性对照和空白对照，每组设置3个复孔；然后，用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度值(A)，每隔12 h检测1次，检测72 h。抑制率=(A对照孔-A实验孔)/(A对照孔-A空白孔)×100%。

1.4 细胞凋亡的检测 将50 μmol/L的β-胡萝卜素加入处于对数生长期的细胞中，继续培养48 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，收集并调整细胞浓度为1×106mL-1，用PBS重悬清洗2次，依次加入100 μL 1×binding buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀后，置于室温避光反应15 min，随后加入500 μL 1×binding buffer，1 h内检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.5 qRT-PCR检测Cav-1 mRNA的表达 收集处理后的细胞，Trizol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，根据qRT-PCR试剂盒说明书进行操作，检测Cav-1 mRNA表达情况，以GAPDH为内参。反应条件：95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s，40个循环。引物序列见表1。mRNA相对表达量的计算采用文献[8]的方法。实验重复3次。

1.6 Cav-1蛋白表达的Western blot检测 在离心收集的细胞中加入裂解液并混匀，置于冰上裂解5～10 min，4 ℃离心收集上清，BCA试剂盒定量蛋白浓度，5×SDS-PAGE Loading Buffer和蛋白提取物以14的比例混匀，90 ℃水浴锅变性10 min，最后置于-70 ℃超低温冰箱保存。采用SDS-PAGE进行蛋白质的分离，每孔上样量为30～50 μg，经120 g/L SDS-PAGE凝胶电泳，将所需大小的条带转印至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，1×TBST洗膜3次，二抗室温孵育2 h，1×TBST洗膜3次，随后化学发光法显色，经暗室曝光，胶片经扫描仪扫描后，利用Image J软件进行灰度分析。实验重复3次。

表1 Cav-1及内参GAPDH引物序列

1.7 统计学处理 应用SPSS 19.0分析。β-胡萝卜素对各组细胞增殖的抑制率采用重复测量数据的方差分析。β-胡萝卜素对各组食管癌细胞凋亡和Cav-1基因表达的影响采用单因素方差分析和SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 正常食管上皮细胞Het-1A和食管癌细胞株中Cav-1蛋白的表达 结果见图1。正常食管上皮细胞Het-1A中没有检测到Cav-1表达，而在食管癌细胞中Cav-1蛋白均呈高表达，其中TE1细胞中表达量最高，Eca109细胞表达量最低。

1：Het-1A;2:TE1;3:EC1;4:Eca109。图1 正常食管上皮细胞 Het-1A及食管癌细胞中Cav-1蛋白的表达

2.2 β-胡萝卜素对食管癌细胞增殖的影响 结果见表2～5。β-胡萝卜素在检测浓度范围内对Het-1A均无明显增殖抑制作用。而在食管癌细胞中，低浓度(1和5 μmol/L)β-胡萝卜素作用下，对其增殖无明显抑制；随着浓度的增加，β-胡萝卜素对食管癌细胞增殖的抑制效果逐渐增强；而抑制率大于50%后，细胞活性及形态逐渐受到严重影响。三株细胞对β-胡萝卜素的敏感性不同，而此敏感性与细胞中Cav-1表达量变化一致。后续实验中选择增殖抑制率为50%时的β-胡萝卜素作用浓度和作用时间，TE1细胞为30 μmol/L β-胡萝卜素处理48 h，EC1、Eca109为50 μmol/L β-胡萝卜素处理48 h。

2.3 食管癌细胞凋亡情况 细胞凋亡情况见表6。实验组细胞凋亡率显著增加，与对照组相比，食管癌细胞凋亡率均提高10倍左右，且β-胡萝卜素对TE1影响最为显著，EC1次之。

表2 β-胡萝卜素对Het-1A细胞增殖的抑制率(n=3) %

F时间=4.821，P=0.924;F浓度=10.141，P=0.059;F交互=3.131,P=0.998。

表3 β-胡萝卜素对TE-1细胞增殖的抑制率(n=3) %

F时间=112.311，P<0.001；F浓度=78.861，P<0.001；F交互=44.012，P=0.002。

表4 β-胡萝卜素对EC1细胞增殖的抑制率(n=3) %

F时间=407.382 ，P<0.001；F浓度=1021.861，P<0.001；F交互=89.012，P=0.009。

表5 β-胡萝卜素对Eca109细胞增殖的抑制率(n=3) %

F时间=88.380，P<0.001；F浓度=131.450，P<0.001；F交互=24.610，P=0.002。

表6 β-胡萝卜素对 食管癌细胞凋亡的影响(n=3) %

*：与其他2组比较，P<0.05。

2.4 β-胡萝卜素对食管癌细胞Cav-1 mRNA表达的影响 结果见表7，β-胡萝卜素能够下调食管癌细胞Cav-1 mRNA水平的表达。

2.5 β-胡萝卜素对食管癌细胞Cav-1蛋白表达的影响 结果见图2，经过30 μmol/L β-胡萝卜素处理TE1细胞48 h及50 μmol/L β-胡萝卜素处理EC1、Eca109细胞48 h后，三株食管癌细胞中Cav-1表达均显著降低。

表7 β-胡萝卜素对 Cav-1基因表达的影响(n=3) %

*：与其他2组比较，P<0.05。

1:空白对照组；2：阴性对照组；3:实验组。图2 β-胡萝卜素对 食管癌细胞Cav-1蛋白表达的影响

3 讨论

β-胡萝卜素在众多类萝卜素中与癌症的关系最为密切。β-胡萝卜素对乳腺癌、结肠癌、胃癌等的增殖抑制作用已经被证实。Wang等[9]发现β-胡萝卜素单独或联合1，25-维生素D3可以有效抑制食管癌EC9706细胞的增殖。该研究结果表明β-胡萝卜素可以有效抑制食管癌细胞增殖，并具有时间和剂量依赖性。30 μmol/L β-胡萝卜素作用TE1 48 h后，细胞增殖抑制率超过50%，50 μmol/L β-胡萝卜素处理48 h后EC1、Eca109细胞抑制率达到50%。同时，作者发现β-胡萝卜素对正常食管上皮细胞Het-1A的增殖没有影响，说明β-胡萝卜素能够特异性地作用于食管癌细胞而对正常细胞无毒性作用，可用于食管癌的化学防治。

随着对Cav-1生物功能的深入研究，越来越多的证据表明Cav-1参与了细胞生长、分化、增殖的生理和病理过程。Yc等[10]通过半定量PCR检测发现，Cav-1基因在食管癌细胞株HKESC-1和HKESC-2中过表达。另外，Kato等[11]通过对130例临床食管癌标本检测后发现，食管癌的不良预后及淋巴结转移与Cav-1过表达有关。因此，Cav-1可能扮演一种促癌蛋白的角色。作者的研究发现，正常食管上皮细胞Het-1A中不表达，而在食管癌细胞株中Cav-1高表达，尤其TE1细胞中Cav-1表达量最高，EC1次之，Eca109最低。该研究结果表明，β-胡萝卜素能够有效促进食管癌细胞凋亡，其中TE1>EC1>Eca109。以上结果与β-胡萝卜素对三株食管癌细胞的增殖抑制作用一致。可以推测，β-胡萝卜素对食管癌的增殖抑制率与Cav-1的表达量有关。该研究结果亦表明，β-胡萝卜素作用食管癌细胞48 h后，Cav-1的mRNA和蛋白质表达水平较对照组显著降低，说明β-胡萝卜素可能通过调控Cav-1影响食管癌的增殖和凋亡。Palozza等[6]发现，Cav-1可以调节β-胡萝卜素对结肠癌细胞和前列腺癌细胞增殖抑制作用的敏感性。这与该研究的结果相一致。

综上所述，β-胡萝卜素对正常食管上皮细胞Het-1A无毒性作用，能够特异性抑制食管癌细胞增殖，促进其凋亡，且Cav-1可能参与并调节食管癌细胞对β-胡萝卜素促凋亡作用的敏感性。

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(2016-05-13收稿 责任编辑李沛寰)

Relationship between β-carotene inducing-apoptosis and Cav-1 expression in human esophageal squamous cancer cells

ZHUXiangzhan1),ZHANGYanting1),HANKang1),LIQinghua1),ZHANGNannan2),MAShanshan1),ZHANGKun1),GUANFangxia1,2)

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)TheFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

β-carotene;esophageal cancer;caveolin-1;cell apoptosis;TE1;EC1;Eca109

Aim: To observe the effect of β-carotene on cell apoptosis in esophageal cancer cells, and analyze the relationship between the sensitivity of esophageal cancer cells to β-carotene and the expression of caveolin-1(Cav-1).Methods: The expressions of Cav-1 protein in normal esophageal epithelial cell line Het-1A and three esophageal cancer cell lines(TE1,EC1,Eca109) were detected by Western blot; after treatment with different concentrations (0, 1, 5, 10, 20, 30 and 50 μmol/L) of β-carotene for 12, 24, 36, 48, 60 and 72 h, the proliferation rate of esophageal cancer cells was tested by CCK8 assay, and the optimal time and concentration of β-carotene were determined; then the cell apoptosis of esophageal cancer cells were detected by Annexin V-FITC/PI staining; the mRNA level of Cav-1 was determined by qRT-PCR, the expression level of Cav-1 protein was detected by Western blot.Results: Cav-1 was over-expressed in esophageal cancer cells (TE1>Eca109>EC1), and was undetectable in Het-1A. CCK-8 assay showed that β-carotene has no effect on Het-1A cells, but inhibited the proliferation of three esophageal cancer cell lines in a dose- and time-dependent manner. In addition, there were relation between the expression of Cav-1 and the sensitivity of esophageal cancer cells to β-carotene. The dose and treatment time of β-carotene when the cell proliferations were decreased nearly 50% were used in the following experiments. After treatment with β-carotene, TE1,EC1 and Eca109 cells had higher apoptosis rate than that of negative control group(P<0.05), especially TE1. In addition, the mRNA and protein level of Cav-1 were both significantly down-regulated. Conclusion: β-carotene can effectively induce apoptosis in esophageal cancer cells, which is non-toxic to the normal esophageal epithelial cell. Moreover, the sensitivity of esophageal cancer cells to the β-carotene may be regulated by Cav-1.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.003

*国家自然科学基金项目 81071008，81471306,U1404313；河南省科技创新人才计划 154200510008；河南省高校科技创新团队

R735.1

15IRTSTHN022；河南省产学研合作项目 142107000008