菌酶协同处理金枪鱼暗色肉制备饲用肽的研究

赵小惠，吴丽娜，杨宇杰，方旭波，2*，余辉，袁高峰，张银照

（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山316022；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江舟山316022；3.浙江丰宇海洋生物制品有限公司，浙江舟山316104）

菌酶协同处理金枪鱼暗色肉制备饲用肽的研究

赵小惠1，吴丽娜1，杨宇杰1，方旭波1，2*，余辉1，袁高峰1，张银照3

（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山316022；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江舟山316022；3.浙江丰宇海洋生物制品有限公司，浙江舟山316104）

本试验以金枪鱼暗色肉为原料，主要研究了枯草芽孢杆菌和中性蛋白酶协同发酵制备饲用肽的最佳工艺条件。以饲用肽的小肽含量为指标，利用单因素试验和正交试验考察了发酵温度、发酵时间、接种量、加酶量等因素对饲用肽中小肽含量的影响。最佳菌酶协同工艺为：发酵温度37℃、发酵时间48 h、接种量2%（V/m）、加酶量200 U/g。在此条件下，小肽含量从28.89 mg/g提高到了185.59 mg/g，氨基酸组成平衡，蛋白质相对分子质量主要分布在6.5～14.4 kD，大分子蛋白得到有效降解。

金枪鱼暗色肉；菌酶协同处理；饲用肽

金枪鱼在加工过程中会产生高达三成以上的鱼肉、鱼骨、鱼皮和内脏等下脚料，其中暗色肉占50%以上。但是由于加工技术滞后，小部分下脚料只能通过压榨、烘干，被简单加工成鱼粉饲料；也有部分被直接丢弃，这既造成资源浪费，又污染了环境，导致产品资源利用率和附加值较低（胡静，2015）。目前，对于金枪鱼暗色肉等下脚料的高值化加工利用主要通过酶解法制备饲料肽，对金枪鱼暗色肉的微生物发酵研究较少。研究表明，采用微生物发酵法制备肽能够提高饲用肽的适口性，提高小肽含量和蛋白质含量，提高消化吸收利用率，而且省去了肽酶和脱苦的成本，简化了生产工序（杨虹坤等，2015；刘峰等，2012）。应用较广泛的蛋白饲料发酵菌种包括乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等，其中枯草芽孢杆菌作为益生菌能通过调节肠道菌群平衡、防止腹泻、提高免疫力等作用，促进动物生长，提高生产性能（祝天龙等，2015）。但是单纯依靠微生物发酵作用所得的小肽含量并不高，而且发酵周期较长（张吉鹍，2010）。因此本试验针对金枪鱼下脚料暗色肉的原料特性，优化枯草芽孢杆菌和中性蛋白酶协同处理金枪鱼暗色肉制备饲用肽的工艺条件，以提高饲用肽的利用率和营养价值，为实际生产饲用肽提供理论指导与技术支撑。

1　材料与方法

1.1试验材料金枪鱼熟制暗色肉，由浙江丰宇海洋生物制品有限公司提供；中性蛋白酶，由广西南宁庞博生物工程有限公司提供；枯草芽孢杆菌，由浙江海洋学院食品与医药学院菌种保藏室提供；分子质量标准品：维生素B12（Mr1335，上海伯奥生物科技有限公司）、抑肽酶（Mr6500，美国Sigma公司）、细胞色素C（Mr14400，美国Sigma公司）、牛血清白蛋白（Mr66700，华美生物工程有限公司）。其他化学试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HHS电热恒温水浴锅，上海棱光技术有限公司；BS110电子分析天平，北京赛多利斯天平有限公司；四方均质器，铁道部电化院四方电气设备厂；DGC-9140A电热恒温鼓风干燥箱，北京林茂科技有限公司；HYP-1004消化炉，上海纤检仪器有限公司；KDN-9140MBE自动定氮仪，上海纤检仪器有限公司；UV-6000紫外分光光度计，苏州江东精密仪器有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪，美国安捷伦有限公司；AKTA Purification10蛋白纯化系统，瑞典安玛西亚公司。

1.3培养基和营养液

1.3.1斜面培养基蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，MnSO4·H2O 5 mg，琼脂15.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.0。

1.3.2摇瓶培养基蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.0。

1.3.3营养液2%（NH4）2·SO4，0.5%葡萄糖，0.4%KH2PO4，0.1%MnSO4。

1.4方法

1.4.1种子液的制备参照孙宏（2013）的方法，从斜面培养基挑取一环枯草芽孢杆菌接入40 mL摇瓶培养基中，在250 mL的三角瓶中于37～40℃温度下培养20～24 h，即得到种子液。

1.4.2饲用肽的制备精确称取50 g金枪鱼暗色肉，于121℃条件下灭菌15 min，冷却到40～50℃。在无菌操作下添加一定量的种子液和一定量的中性蛋白酶，并加入50 mL的营养液调节物料含水量至30%～40%(m/m)。混合均匀后将物料分装入若干个三角瓶中，用六层纱布封口。置于恒温培养箱发酵一定时间后取出，50℃烘干，粉碎过80目筛后即得饲用肽，备用待测。

1.4.3菌酶协同工艺的单因素试验

1.4.3.1发酵温度对饲用肽的小肽含量的影响在发酵时间36 h，接种量1%（V/m），加酶量250 U/g条件下发酵，温度分别选择21、30、37、44℃，发酵结束后，测定饲用肽的小肽含量。

1.4.3.2发酵时间对饲用肽的小肽含量的影响在发酵温度30℃，接种量1%（V/m），加酶量250 U/g条件下，分别发酵12、24、36、48、60 h，发酵结束后，测定饲用肽的小肽含量。

1.4.3.3接种量对饲用肽的小肽含量的影响在发酵温度30℃，发酵时间36 h，加酶量250 U/g条件下，分别接种0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%（V/m）的种子液，发酵结束后，测定饲用肽的小肽含量。

1.4.3.4加酶量对饲用肽的小肽含量影响在发酵温度30℃，发酵时间36 h，接种量1%（V/m）条件下，分别添加中性蛋白酶0、100、150、200、250、300、350 U/g，发酵结束后，测定饲用肽的小肽含量。

1.4.4菌酶协同工艺的正交优化试验根据单因素试验结果，以接种量、加酶量、发酵温度、发酵时间为试验因子，进行四因素三水平L9（34）的正交优化试验，以饲用肽的小肽含量为指标，筛选出优化组合。

1.4.5饲用肽的测定项目及方法

1.4.5.1饲用肽常规成分分析粗蛋白质含量依据GB/T 5009.5—2010凯氏定氮法测定；粗脂肪含量依据GB/T 5512—2008测定；粗灰分含量依据GB/T 6438—2007测定。

1.4.5.2小肽含量测定饲用肽测定参照陈升军等（2008）的方法。

1.4.5.3氨基酸成分分析氨基酸测定参照胡燃等（2015）的方法。

1.4.5.4饲用肽的蛋白质相对分子质量测定菌酶协同发酵后的金枪鱼暗色肉蛋白经AKTA蛋白纯化系统凝胶色谱柱分离后，与标准品比较。选用牛血清白蛋白、细胞色素C、抑肽酶、维生素B12作为相对分子量标准品。AKTA蛋白纯化系统凝胶条件为流动相：0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.2；分析柱：Superdex75 10/300 GL预装柱；色谱设备：AKTA蛋白纯化系统；流速：1 mL/min；检测波长：220 nm。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1不同发酵温度对小肽含量的影响由图1可知，在23、30、37、44℃条件下发酵时，饲用肽的小肽含量分别较未发酵提高72.17、121.07、132.35、121.45 mg/g。在37℃下发酵时，小肽含量提高幅度最大，此时小肽含量为161.24 mg/g。当温度为44℃时，小肽含量较37℃下降10.9 mg/g，这可能是由于温度过高会影响枯草芽孢杆菌的生长繁殖，从而减小产酶量和减弱了蛋白酶的活力，同时影响中性蛋白酶的活力，因此饲用肽的小肽含量呈下降趋势。所以可确定较佳的发酵温度为37℃（图1）。

2.1.2不同发酵时间对小肽含量的影响由图2可知，在发酵12、24、36、48、60 h后，饲用肽的小肽含量分别较未发酵提高59.97、93.9、121.07、130.1、126.49 mg/g。发酵48 h时小肽含量提高幅度最大，小肽含量高达159.05 mg/g。发酵60 h后小肽含量呈现下降趋势可能是部分小肽分解成为游离氨基酸；也可能是因为随着发酵的进行，营养物质被消耗，营养物质的缺乏影响枯草芽孢杆菌代谢活动，大大减少蛋白酶的生成；也可能是发酵时间过长容易感染一些其他杂菌，产生的代谢产物会影响发酵环境。从生产成本考虑，确定48 h是较佳的发酵时间。

图2　不同发酵时间对小肽含量的影响

2.1.3不同接种量对小肽含量的影响从图3可知，在接种量为0.5%、1.0%、2%、3%、4%（V/m）条件下发酵，饲用肽的小肽含量分别较发酵前提高73.67、121.07、131.36、130.24、129.25 mg/g。在2%时，饲用肽的小肽含量提高幅度最大，小肽含量达到160.25 mg/g。不断接种种子液，小肽含量变化呈先增加、后平缓的趋势，说明初始发酵环境中的营养物质比较充足，增大接种量会提高小肽含量；随着接种量进一步的增大，金枪鱼暗色肉中的营养物质被消耗大半，枯草芽孢杆菌菌种代谢受到抑制，从而导致小肽含量有所下降。所以本试验选择2%（V/m）作为较佳的接种量。

图3　不同接种量对小肽含量的影响

2.1.4不同加酶量对小肽含量的影响蛋白酶可将多种蛋白质水解为小分子的肽类及氨基酸，因此加酶量是影响菌酶协同制备饲用肽的重要变量之一。由图4可知，当加酶量为100、150、200、250、300、350 U/g时，饲用肽的小肽含量分别较发酵前提高了71.66、111.39、119.28、122.07、120.96、119.56 mg/g。所以当添加250 U/g的蛋白酶时，小肽含量提高最大，小肽含量达到最高，为149.96 mg/g。在继续添加中性蛋白酶，小肽含量的变化不大，这说明一定范围内的加酶量能有效提高小肽含量，再添加蛋白酶出现下降趋势，可能是因为过量的蛋白酶把小肽进一步水解为游离氨基酸。所以本试验确定250 U/g作为较佳的加酶量。

图4　不同加酶量对小肽含量的影响

2.2正交试验结果根据单因素试验结果，以饲用肽的小肽含量为考察指标，以发酵温度、发酵时间、接种量、加酶量为考察因子，进行四因素三水平L9（34）的正交优化试验，试验设计与结果如表1所示。

试验结果显示，四个因素对试验结果影响的主次顺序为接种量>加酶量>发酵温度>发酵时间，接种量、加酶量较发酵温度、发酵时间对小肽含量影响大。较佳菌酶协同组合为A2B2C2D2即发酵温度37℃，发酵时间48 h，接种量2.0%（V/m），加酶量200 U/g，此组合与单因素试验得出菌酶协同组合A2B3C2D2相比，加酶量不同。对单因素试验结果分析可知，加酶量有一个逐渐饱和的趋势，之后继续提高加酶量，小肽含量有下降趋势。因此对这两个组合分别进行3次验证试验，测得小肽含量分别为（185.28±0.31）mg/g和（182.59±0.27）mg/g。结果表明A2B3C2D2组合没有A2B2C2D2组合小肽含量高。所以从生产成本和效率考虑，确定发酵温度37℃，发酵时间48 h，接种量2.0%（V/m），加酶量200 U/g为最佳菌酶协同工艺。

表1　正交试验设计与结果

2.3饲用肽的主要成分

2.3.1饲用肽的常规成分表2的结果表明，与原金枪鱼暗色肉相比，饲用肽的粗蛋白质含量和小肽含量较高，分别较发酵前提高11.2 mg/g和156.7 mg/g；粗脂肪、灰分含量有所下降，分别较未发酵前下降2.01 mg/g和2.26 mg/g。

表2　饲用肽的常规成分测定mg/g

2.3.2饲用肽的氨基酸组成经过酸处理后，总氨基酸含量较未发酵前提高7.19 g/100 g；各氨基酸中增加幅度最大的氨基酸是谷氨酸，较未发酵前提高1.31 g/100 g；必需氨基酸中赖氨酸的含量增加最多，较未发酵提高0.41 g/100 g；呈味氨基酸中，甘氨酸含量较未发酵前提高0.82 g/100 g，天冬氨酸含量较未发酵前提高0.93 g/100 g，谷氨酸含量较未发酵前提高1.31 g/100 g，从而能有效减少饲用肽的苦味。可见，经菌酶协同处理后，饲用肽中各种氨基酸组成比例平衡，必需氨基酸种类丰富。

表3　饲用肽的氨基酸组成分析g/100 g

2.3.3饲用肽的蛋白质相对分子质量分布菌酶协同处理后的金枪鱼暗色肉蛋白经AKTA蛋白纯化系统凝胶色谱柱分离后，与标准蛋白进行比较，其蛋白质的相对分子质量大部分集中在6.5～14.4 kD，小于1.3 kD也占部分，说明饲用肽中的大部分蛋白质得到有效降解，以多肽、小肽或氨基酸形式存在（图5）。由此可见，经菌酶协同处理后，提高了饲用肽的吸收利用率，有效提升了饲用肽的营养品质。

图5　饲用肽的蛋白质相对分子质量分布

3　结论

经过单因素试验和正交试验优化，确定了菌酶协同处理金枪鱼暗色肉制备饲用肽的最佳发酵工艺为发酵温度37℃，发酵时间48 h，接种量2.0%（V/m），加酶量200 U/g。在此条件下，小肽含量从28.89 mg/g提高到185.59 mg/g；蛋白质分子质量集中在6.5～14.4 kD，说明经菌酶协同处理后的大分子蛋白得到良好的降解，饲用肽的利用率得到提高；对氨基酸组成分析可知饲用肽的总氨基酸含量丰富，氨基酸比例适当，且必需氨基酸含量平衡。

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An orthogonal experiment was conducted to investigate the optimal conditions of tuna dark meat fermentation by bacillus subtilis and a neutral protease for small peptides production.With the yield of small peptides as index，fermentation temperature，fermentation time，inoculation and additive amount of enzyme were determined，through single-factor and orthogonally experiment.The optimal fermentation methods were obtained：fermentation temperature was 37℃，fermentation time was 48 h，inoculums size of bacillus subtilis was 2.0%,and 200 U/g of neutral protease.Under these conditions，the content of small peptides increased from 28.89 mg/g to 185.59 mg/g，amino acid composition was balanced，protein molecular weight mainly was 6.5～14.4 kD，and macromolecular protein was effectively degraded away.

tuna dark muscle；bacteria and neutral enzyme synergy fermentation；feed peptide

S816.7

A

1004-3314（2016）10-0019-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161006

浙江省科技计划项目（2015C32034）；国家级大创项目（14131062713）