食管鳞状细胞癌组织中血管内皮生长因子C、D的表达变化及意义

马俊，鲁建军，缪蓉，巫国勇，罗红鹤

(中山大学附属第一医院，广州510080)



食管鳞状细胞癌组织中血管内皮生长因子C、D的表达变化及意义

马俊，鲁建军，缪蓉，巫国勇，罗红鹤

(中山大学附属第一医院，广州510080)

目的 观察食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中血管内皮生长因子C(VEGF-C)、VEGF-D的表达变化，并探讨二者与ESCC转移、复发的关系。方法 收集60例ESCC患者的肿瘤组织及癌旁正常组织标本。用免疫组化法检测组织中VEGF-C、VEGF-D阳性表达率及表达水平，计算ESCC组织微血管密度(MVD)、微淋巴管密度(MLVD)；分析VEGF-C、VEGF-D表达水平与ESCC患者临床病理参数的关系；采用Spearman等级相关分析VEGF-C、VEGF-D表达水平与MVD、MLVD的关系；患者均行CE根治术，术后随访1年，观察复发或转移患者肿瘤组织中VEGF-C、VEGF-D表达水平；采用Logistic回归对ESCC淋巴结转移的影响因素进行分析。结果 ESCC组织与癌旁正常组织中VEGF-C、VEGF-D的阳性表达率、相对表达量比较差异有统计学意义(P均<0.05)。VEGF-C、VEGF-D表达水平与ESCC淋巴结转移、临床分期有关(P均<0.05)，VEGF-C表达水平还与肿瘤浸润深度有关(P均<0.05)。经Spearman等级相关分析发现，ESCC组织中VEGF-C表达水平与MLVD、MVD呈正相关(r分别为0.521、0.561，P均<0.05)；VEGF-D表达水平与MLVD呈正相关(r=0.660，P<0.05)。术后复发转移患者ESCC组织VEGF-C、VEGF-D相对表达量高于术后无复发转移患者(P均<0.05)。经Logistic回归分析发现，VEGF-C、VEGF-D及肿瘤浸润程度是ESCC患者淋巴结转移的独立危险因素(OR分别为8.321、7.683、0.104，P<0.05)。结论 ESCC组织中VEGF-C和VEGF-D呈高表达，二者与ESCC转移、复发有关。

食管鳞状细胞癌；血管内皮生长因子C；血管内皮生长因子D；微血管密度；微淋巴管密度

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，男性发病率和病死率为女性的2～4倍[1]。我国是食管癌高发国家之一，以食管鳞状细胞癌(ESCC)为主，约占食管癌总数的90%[2]。血管内皮生长因子(VEGF)是具有促血管内皮细胞有丝分裂活性的一种糖基化碱性蛋白。VEGF家族共有7个成员：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子，均为同源二聚体糖蛋白，具有相似的空间结构，在新生血管生成和淋巴管生成等方面有重要的调节作用[3]。目前研究认为，VEGF-C、VEGF-D对促进肿瘤组织中新生血管形成及淋巴管生成起重要作用[4，5]，然而其具体作用机制尚未完全清楚。本研究观察ESCC组织VEGF-C、VEGF-D的表达变化，并探讨二者与ESCC转移、复发的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012年6月～2013年9月本院收治的ESCC患者60例，均经病理检查确诊，均行CE根治术治疗，术前均未接受放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗。其中男42例、女18例，年龄(59.37±9.13)岁，通过手术切除肿瘤组织及距肿瘤组织4 cm的正常组织制作石蜡标本。

1.2 ESCC组织及癌旁正常组织VEGF-C、VEGF-D表达检测 采用免疫组化法。取ESCC组织及癌旁正常组织标本，包埋、切片脱蜡至水、抗原修复、3%过氧化氢孵育、山羊血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、辣根酶标记、DAB显色、苏木素复染及脱水、透明、封片、镜检。VEGF-C和VEGF-D阳性细胞染色呈浅黄色至棕黄色，定位于细胞质内，以阳性细胞百分比≥30%为阳性表达。采用Image-proplus 6.0软件分析5个视野的光密度值，以平均光密度值作为VEGF-C、VEGF-D的相对表达量。

1.3 ESCC组织微血管密度(MVD)、微淋巴管密度(MLVD)测算 采用免疫组化法。CD31蛋白染色阳性定位于血管内膜，呈现黄色至棕黄色颗粒。以CD31染色阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个单独的可数微血管。低倍镜下定位血管高密度区域，高倍镜下随机计数5个视野微血管数量，计算平均值即为MVD[6]。D2-40染色阳性定位于肿瘤内淋巴管中，呈棕黄色，D2-40染色阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇为一个阳性微淋巴管，低倍镜下寻找D2-40染色阳性密集区域，高背景下随机选择5个视野计数微淋巴管数量，以其平均值作为MLVD[7]。

2 结果

2.1 ESCC组织及癌旁正常组织中VEGF-C、VEGF-D表达比较 ESCC组织及癌旁正常组织VEGF-C阳性表达率分别为68.33%(41/60)、7.14%(4/60)，VEGF-D阳性表达率分别为56.67%(34/60)、3.45%(2/60)，ESCC组织与癌旁正常组织中VEGF-C、VEGF-D的阳性表达率比较差异有统计学意义(P均<0.05)。ESCC组织及癌旁正常组织中VEGF-C相对表达量分别为0.250±0.043、0.074±0.046，VEGF-D相对表达量分别为0.241±0.028、0.075±0.045，ESCC组织与癌旁正常组织VEGF-C、VEGF-D相对表达量比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.2 VEGF-C、VEGF-D表达水平与ESCC患者临床病理参数的关系 VEGF-C、VEGF-D表达水平与ESCC淋巴结转移、临床分期有关(P均<0.05)，VEGF-C表达水平还与肿瘤浸润深度有关(P<0.05);二者与性别、年龄、肿瘤分化程度和浸润深度无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 ESCC组织中VEGF-C、VEGF-D表达与MLVD、MVD的关系 ESCC组织中VEGF-C、VEGF-D表达与MLVD、MVD的关系见表2。经Spearman等级相关分析发现，ESCC组织中VEGF-C表达水平与MLVD、MVD呈正相关(r分别为0.521、0.561，P均<0.05)；VEGF-D表达水平与MLVD呈正相关(r=0.660，P<0.05)，与MVD无相关性(r=0.212，P>0.05)。

2.4 VEGF-C、VEGF-D表达水平与ESCC患者预后的关系 60例患者术后1年出现肿瘤复发或转移24例。术后复发转移患者ESCC组织中VEGF-C、VEGF-D相对表达量(0.274±0.049、0.252±0.032)高于术后无复发转移患者(0.183±0.034、0.189±0.011)，比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

表1 VEGF-C、VEGF-D表达水平与ESCC患者临床病理参数的关系±s)

表2 ESCC组织中VEGF-C、VEGF-D表达与MLVD、MVD的关系

2.5 ESCC淋巴结转移的影响因素 经Logistic回归分析发现，VEGF-C、VEGF-D阳性表达及肿瘤浸润程度(OR分别为8.321、7.683、0.104，P均<0.05)是ESCC患者淋巴结转移的影响因素。

3 讨论

ESCC早期可通过淋巴管扩散到局部淋巴结。VEGF家族中的VEGF-C被认为能够促进肿瘤新生血管生成。VEGF-C和VEGF-D是主要的淋巴管生成因子，在肿瘤淋巴管生成中起重要作用[8]。VEGF-C在结直肠癌、胃癌等多种消化道肿瘤组织中高表达，并被认为与肿瘤的浸润程度、淋巴管侵犯及淋巴结转移密切相关。VEGF-C在头颈部鳞癌组织中高表达，被认为可促进新生血管生成及淋巴管增生[9]。在非小细胞肺癌[10]、乳腺癌[11]、黑色素瘤[12]等实体肿瘤组织中均发现VEGF-C蛋白表达明显高于相应部位的正常组织或癌旁正常组织，且其表达水平与淋巴管形成、淋巴结转移及预后密切相关。在现有的研究中，多数支持VEGF-D与多种恶性肿瘤淋巴管生成和淋巴道转移相关。VEGF-D不但可促进肿瘤内部的淋巴管生成，而且可诱导肿瘤细胞向淋巴结扩散，VEGF-D的特异性抗体可阻断这种淋巴道播散。VEGF-D在口腔鳞癌中的表达高提示肿瘤的淋巴结转移率较高[13]。对胃癌的研究表明，VEGF-D的阳性表达与胃癌的淋巴结转移显著相关[14]，这种相关性甚至出现在早期的淋巴结微转移中。本研究不仅用了传统的阳性表达率来定性表述VEGF的表达情况，还联合应用光密度值来定量描述其表达情况，使结果更加具有说服力。本研究发现，ESCC肿瘤组织中VEGF-C、VEGF-D的阳性表达率和相对表达量均高于癌旁正常组织，该结果说明VEGF-C、VEGF-D促进了ESCC的发生发展。

肿瘤组织的淋巴管形成是一个涉及淋巴管内皮细胞、细胞外基质及包括肿瘤细胞在内的多因素、多步骤的复杂过程。本研究发现，在ESCC组织中，VEGF-C、VEGF-D的表达水平与有无淋巴转移、临床分期以及有无复发转移密切相关，在有淋巴结转移、临床分期较晚及术后复发转移的ESCC组织中，VEGF-C、VEGF-D具有较高的表达水平；同时，本研究选用D2-40单克隆抗体对ESCC组织的MLVD进行定量检测，在ESCC组织中，VEGF-C、VEGF-D表达水平与MLVD均呈正相关。以上结果证实VEGF-C、VEGF-D是肿瘤淋巴管生成的诱导剂，促进了淋巴管的生成。且VEGF-C表达水平还与MVD呈正相关，说明VEGF-C还与肿瘤浸润程度有关。复发与转移是癌症的主要特征。也是肿瘤患者预后的重要不利因素，在Logistic回归分析中发现，VEGF-C、VEGF-D阳性表达以及肿瘤浸润程度是ESCC术后复发转移的独立影响因素，能够预测患者的术后预后状态。

综上所述，VEGF-C、VEGF-D在ESCC组织中的表达水平升高，促进了ESCC的肿瘤发生发展，并且参与了肿瘤组织中的淋巴管生成，与ESCC的淋巴转移密切相关，可以作为患者预后的重要依据。

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