郭明日,张丽霞,周洪经,李玉明,孙海柏,张立
(1天津市海河医院,天津300350;2天津市呼吸疾病研究所;3国家中医药管理局中医药防治传染病重点研究室)
Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB及BACTEC MGIT960在结核病诊断中的应用
郭明日1,2,3,张丽霞1,2,周洪经1,2,李玉明1,2,孙海柏1,2,张立1,2
(1天津市海河医院,天津300350;2天津市呼吸疾病研究所;3国家中医药管理局中医药防治传染病重点研究室)
目的 探讨Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB及BACTEC MGIT960在结核病诊断中的应用价值。方法 选择180例受试者,其中肺结核98例、肺外结核35例及非结核病47例。所取受试者痰、支气管灌洗液、脑脊液等标本分别采用Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB及BACTEC MGIT960单独检测及联合检测,用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)评价各检测方法的诊断效能,采用Kappa检验分析Xpert MTB/RIF与BACTEC MGIT960对利福平耐药性检测的一致性。结果 T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB对肺结核与肺外结核检测的阳性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT 960单独检测及二者联合检测(P均<0.05)。T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB诊断结核病的AUC比较差异无统计学意义(P均>0.05),但均大于Xpert MTB/RIF、MGIT 960、Xpert MTB/RIF+MGIT960的AUC(P均<0.05)。Xpert MTB/RIF与BACTEC MGIT960对利福平耐药性检测具有较高的一致性(κ=0.735)。结论 T-SPOT·TB检测、T-SPOT·TB联合MGIT960检测、三者联合检测对结核病诊断有较高价值,三者联合检测的价值最高。
结核病;结核分枝杆菌/利福平耐药基因检测;结核感染T细胞斑点试验;自动分枝杆菌培养及药敏检测系统
近年来,分子生物学技术及免疫学技术的发展为结核病的快速诊断及结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测提供了新的方法。MTB/利福平耐药基因检测(Xpert MTB/RIF)是一种新型的MTB感染及利福平耐药性分析的分子诊断平台,由美国Cepheid公司研发,目前该分子诊断技术受到广泛关注。结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT·TB)是一种使用MTB特异性抗原刺激外周血单个核细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)的量来判断是否存在MTB感染的免疫学技术。自动分枝杆菌培养及药敏检测系统(BACTEC MGIT960)采用荧光法原理,感应培养管内氧浓度的消耗情况来反映MTB生长状态,可24 h连续监测。2015年1~6月,本研究探讨Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB与BACTEC MGIT960在结核病诊断中的价值。
1.1 临床资料 选择同期住院患者180例,男111例、女69例,年龄15~86岁、平均40岁;根据《内科学》[1]第8版诊断标准,诊断为肺结核98例、肺外结核35例(其中结核性胸膜炎16例、胸/腰椎结核11例、淋巴结核3例、结核性脑膜炎4例,肾结核1例)、非结核病47例(肺炎25例、慢性阻塞性肺气肿9例、胸膜炎6例、支气管哮喘患者5例、支气管扩张2例)。标本采集:痰标本:患者清水漱口2次后打开无菌痰瓶,深吸气用力从肺部深处咳出痰,收集于痰瓶中,拧紧瓶盖,痰样本保存于2~8 ℃,及时送检。支气管灌洗液、脑脊液、胸腹水、穿刺液标本:按照临床无菌操作规程进行采集。尿液:收集24 h尿。其中痰标本89份、支气管灌洗液47份、脑脊液4份、胸腹水20份、脓液19份、尿液1份。支气管灌洗液、脑脊液、胸腹水、尿液标本检测前以3 000 g离心20~30 min,沉淀部分加入磷酸盐缓冲液1 mL混匀后进行后续试验。
1.2 Xpert MTB/RIF检测 按每1 mL标本加入2 mL标本处理液,旋紧样本盒盖,涡旋振荡20 s,室温静置15 min,取处理后样品2 mL加入Xpert MTB/RIF反应盒,置于检测模块,仪器自动检测,2 h后系统自动判读MTB检测结果与利福平耐药结果。MTB培养结果分为阴性和阳性,利福平检测结果分为敏感和耐药。
1.3 T-SPOT·TB试验 收集患者外周静脉血5 mL,分离得外周血单个核细胞(PBMCs),洗涤后细胞计数;PBMCs和结核特异抗原早期分泌抗原靶蛋白6及培养滤液蛋白10同时加入预包被有IFN-γ抗体的反应孔中,孵育过夜(37℃、5% CO2);次日洗板,加入二抗,孵育1 h后再次洗板,加入底物显色液孵育7 min,蒸馏水终止反应,记录斑点形成细胞(SFCs)数,1个斑点代表1个效应T淋巴细胞。结果判读:阴性对照孔斑点数<6时,ESAT-6或CFP-10抗原孔斑点数-阴性对照孔斑点数≥6判定为阳性;阴性对照孔斑点数≥6时,检测孔斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数,判定为阳性。
1.4 BACTEC MGIT960检测 取菌悬液1 mL用生理盐水4 mL稀释,取稀释后的菌液100 μL加入生理盐水9.9 mL再次稀释,取按1∶50稀释的菌液500 μL加入1支MGIT培养管中混匀。取4支MGIT培养管,分别标记药物名称,每管加入OADC营养添加剂500 μL,每管分别加入药物原液100 μL、1∶5稀释的待测菌液500 μL,连同生长对照管一起放入仪器孵育培养。MTB培养结果判读:BACTEC MGIT960探测仪隔60 min连续自动测定培养管内荧光强度变化,计算机分析判断管内MTB生长情况,出现阳性标本,仪器红色指示灯闪亮,伴提示音,取出阳性标本经抗酸染色为阳性的确定为MTB阳性,该阳性标本再经对硝基苯甲酸生长试验、28 ℃生长试验、耐热触酶试验、噻吩-2-羧酸肼试验后判断为MTB阳性或阴性。药敏结果判读:当生长对照管为阳性时,仪器开始判读药敏管,并连续判读2 d的结果。当药敏管在生长对照管出现阳性后2 d内仍未生长则为敏感,有细菌生长则为耐药。
2.1 三种方法单独检测及联合检测结果比较 T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB对肺结核与肺外结核检测的阳性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT 960单独检测及二者联合检测,差异有统计学意义(P均<0.05)。 见表1。
表1 三种方法单独检测及联合检测结果比较[例(%)]
2.2 三种方法单独检测及联合检测诊断结核病的效能比较 T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB诊断结核病的AUC比较差异无统计学意义(P均>0.05),但均大于Xpert MTB/RIF、MGIT 960、Xpert MTB/RIF+MGIT960的AUC(P均<0.05)。见表2。
表2 三种方法单独检测及联合检测诊断结核病的AUC比较
2.3 Xpert MTB/RIF与BACTEC MGIT960对利福平耐药性的检测结果比较 两种方法对利福平耐药性检测的一致性比较采用Kappa检验,κ=0.735,表明Xpert MTB/RIF和MGIT960对利福平耐药性的检测具有较高的一致性。
Xpert MTB/RIF试验是WHO推荐用于检测结核病的分子诊断平台,是以半巢式实时荧光PCR技术为基础,rpoB基因利福平耐药决定区(RRDR)的81 bp核心区为靶序列,可在2 h内检出MTB和利福平的耐药性[2],由于利福平单药耐药非常少,临床上常将利福平耐药作为耐多药结核病标志物[3,4]。T-SPOT·TB是检测血液中分泌IFN-γ、抗原特异的T淋巴细胞最为敏感的技术,很少会受到CD4+T淋巴细胞数量少的影响。该技术对于结核病合并免疫缺陷者,仍是一种较为适宜的诊断方法[5,6]。MGIT960则是目前应用最广的MTB培养和药敏的试验方法。
肺结核与肺外结核患者采用以上三种检测方法进行检测,阳性率均高于非结核患者。肺结核与肺外结核患者经T-SPOT·TB检测阳性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT960单独检测,差异有统计学意义;用T-SPOT·TB、MGIT960或Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB与MGIT960联合检测,阳性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT 960单独检测及二者联合检测,差异有统计学意义。以临床诊断为参照,三种方法诊断结核病的AUC均>0.7,T-SPOT·TB与其余两种方法比较,差异有统计学意义,Xpert MTB/RIF与BACTEC MGIT960比较,差异无统计学意义;诊断方法联用后,T-SPOT·TB、MGIT960联合诊断的AUC明显高于MGIT960,Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB、MGIT 960联合诊断的AUC明显高于单用Xpert MTB/RIF或MGIT 960检测。可能因为,Xpert MTB/RIF与MGIT 960均直接检测样本中的MTB,因此,对于菌阴结核病患者,其检出率将受影响,临床可根据具体情况灵活选择检测方法。关于T-SPOT·TB诊断结核病的价值,不同的文献报道不一致。Qiu等[7]进行的多中心、大样本调查结果显示,以临床诊断为参照,T-SPOT·TB诊断结核病的灵敏度和特异度分别为78.2%和91.1%。亦有文献报道,其灵敏度和特异度为83.3%和80.1%,且患者的年龄、性别、免疫抑制状态、肿瘤等因素对其试验结果均无影响[8]。Yan等[9]报道,T-SPOT·TB诊断肺结核的灵敏度高于肺外结核,诊断未经治疗结核病的灵敏度高于正在治疗中活动性结核病,故该试验对于结核病治疗效果的评估有一定价值。此外,T-SPOT·TB亦可用于结核病与非结核病的鉴别诊断[10]。研究结果显示,Xpert MTB/RIF在肺外结核病的诊断有较高价值,敏感度为0.78,特异度为0.99[11]。由于Xpert MTB/RIF可在2 h内检出样本中是否有MTB及对利福平的耐药性,因此相对于MGIT960需要数周的时间才能出具培养及药敏结果优势非常明显。夏辉等[12]分析了Xpert 技术在我国的应用前景,建议将其整合入我国结核病防治规划。
Xpert MTB/RIF可直接检测MTB的核酸并可检出其对利福平的耐药性,对耐药结核病的快速诊断有重要意义,且其操作简易,可有效避免基因检测污染的问题。T-SPOT·TB则是检测MTB所分泌的ESAT-6和CFP-10所引起的T细胞介导的IFN-γ反应,对于早期结核病及菌阴结核病患者有较大诊断价值。BACTEC MGIT960则可对MTB进行快速培养并获得临床一线抗结核药物的药敏结果。T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB对结核病的诊断效能高于其他方法,三者联合检测效能最高。
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B
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