肝细胞肝癌内NAP1L1的表达及其临床意义

乐 勇 欧阳晗月 张永法 郭荣平 石 明



·基础研究·

肝细胞肝癌内NAP1L1的表达及其临床意义

乐 勇 欧阳晗月 张永法 郭荣平 石 明

目的 探讨肝癌组织中核小体组装蛋白1-like-1(NAP1L1)的表达情况。方法 应用免疫组化法检测173例肝癌及癌旁肝组织中NAP1L1的表达情况。结果 NAP1L1蛋白在癌旁肝组织中不表达,而在肝癌组织中高表达且表达阳性率为28.32%(49/173)，且NAP1L1表达上调与肝硬化、AFP水平显著相关。结论 NAP1L1在肝癌组织中高表达提示着患者的不良预后,表明NAP1L1在肝癌的发生、发展中可能起着一定的作用。

肝癌；NAP1L1；预后

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1741～1743)

NAP1L1是核小体组装蛋白1-like(NAP1L)家族中的一员，最早是从人胸腺组织中发现[1]。目前，核小体组装蛋白家族的成员发现有5种(NAP1L1～5)，其中NAP1L1和NAP1L4广泛表达于人体的各种组织器官中[2]，且在增值的细胞中其mRNA和蛋白明显升高；表明它们有着增殖的作用。NAP1L2、NAP1L3、NAP1L5特异性表达于神经元内，其主要参与神经元的分化、增值和凋亡[3-4]。核小体组装蛋白家族成员都有着介导核小体组装的功能，其中NAP1L1却有着更高的核小体去组装能力[5]。和成年人的肝脏相比，胎肝内的NAP1L1表达较高[6]；同样肝母细胞瘤内NAP1L1的蛋白水平高于正常成年人的肝脏[7]。约50%的结肠癌内呈现高表达的NAP1L1[8]；同时也有报道称和正常小肠粘膜相比，小肠腺类癌内NAP1L1表达升高[9]。此外，还有其他研究表明NAP1L1在肿瘤组织中明显高表达，并与肿瘤增殖，侵袭相关[10]。然而，目前尚无相关研究阐述NAP1L1与肝癌的关系。因此，本文目的在于探讨NAP1L1蛋白在肝癌癌巢及癌旁非肿瘤组织中的表达情况；并结合患者相关资料分析其肝癌内的预后意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

入组肝癌患者:收集2005年至2008年间于我院肝胆科行手术切除治疗的原发性肝癌病例173例，入组标准：①首次就诊诊断为原发性肝癌并未接受任何治疗；②无腹腔积液及肝性脑病；③肝功能分级为Child-Pugh A级。临床分期采用第七版TNM分期系统，病理分级则采用Edmondson-Steiner分级法。随访资料均来自于我院随访科。入组患者的相关资料见表1。

1.2 主要试剂和仪器

免疫组化用NAP1L1兔抗人多克隆抗体一抗购自美国sigma公司；免疫组化用鼠/兔通用二抗及DAB显色系统等均购自丹麦Dako公司。

1.3 免疫组织化学染色的主要步骤及结果判定

免疫组化主要步骤：二甲苯脱蜡和梯度酒精水化后，依次经3%过氧化氢10 min、柠檬酸缓冲液微波修复高火，5 min；中低火25 min。滴加NAP1L1一抗4 ℃过夜，室温平衡至少30 min。滴加二抗后于37 ℃孵育30 min。PBS漂洗后经DAB显色约2 min。双蒸水漂洗4次后苏木精复染1 min，自然晾干后中性树脂封片。

结果判定：按照细胞着色的强度分为四个等级：无细胞着色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分；棕色为3分。同时评出阳性细胞分布百分数。然后运用积分综合计量法；即每种阳性强度对应的值×该强度细胞的百分比，然后求和。以中位数为分界点，将肝癌患者分为NAP1L1阴性表达组和阳性表达组。

1.4 统计学处理

应用全SPSS 19.0软件进行分析，χ2检验分析 NAP1L1表达水平与肝癌患者临床病理资料的相关性； NAP1L1阴性和阳性肝癌患者的生存曲线采用Kaplan-Meier方法绘制，Log-Rank检验用于比较生存曲线间的差异。P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 NAP1L1在肝癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达情况

在癌旁非肿瘤组织中NAP1L1完全不表达，无论是在实质细胞还是间质细胞中均无阳性信号；而在肝癌组织中呈现不同强度的表达；且其信号主要定位于肿瘤细胞胞质内。并且根据前述结果判定方法将患者分为NAP1L1阳性表达组和阴性表达组。

2.2 NAP1L1表达与肝癌临床病理资料的关系

结果表明，NAP1L1表达与甲胎蛋白水平、肝硬化程度存在一定的相关性，而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数目、癌栓、TNM分期等指标无明显相关性，见表1。

2.3 NAP1L1表达水平与肝癌患者预后的关系

生存分析显示，NAP1L1表达阳性的肝癌患者其中位生存时间为 45.39 个月，而阴性患者仅为 58.12 个月，差异具有统计学意义，见图1。

3 讨论

肝细胞肝癌是1种常见的高侵袭性恶性肿瘤，有着很高的复发率和死亡率。近年来出现了许多治疗方式，例如：射频治疗，微波消融，生物治疗等；肿瘤切除仍然是目前主要的根治性治疗方式，但预后多不良，其5年复发率仍高达70%左右[11-12]。因此，深入研究肝细胞肝癌的发生和进展的分子机制，有助于肝癌的个体化诊治。

表1 NAP1L1表达与肝癌临床病理资料的相关性/例

图1 NAP1L1表达与肝癌患者生存曲线图

NAP1L1是核小体组装蛋白家族中的一员，其主要功能是参与核小体的组装。核小体是由H2A，H2B，H3，H4这4个亚基构成的八聚体；其中NAP1L1就是作为分子伴侣参与H2A-H2B的组装[13]。因此认为NAP1L1是主要功能是参与细胞的增殖；还有些研究表明，NAP1L1可以通过NOTCH1信号通路介导细胞的分化过程[14]。在肝癌组织中我们的发现NAP1L1蛋白表达的阳性率约为28.32%(49/173)，且其阳性信号集中在肝癌细胞质中。而在癌旁的非肿瘤组织中，NAP1L1蛋白则完全不表达；提示肝癌组织中NAP1L1的表达呈现不同程度的上调。进一步与患者的临床相关资料分析得出NAP1L1的高表达与患者AFP水平和肝硬化程度呈现一定的相关性；而与患者的其他资料例如：肿瘤的分期、肿瘤大小、数目、是否有癌栓等则无明显相关性。通过生存分析表明NAP1L1表达阳性的肝癌患者其中位生存期明显低于NAP1L1表达阴性患者(45.39个月 VS 58.12个月；P=0.022)，提示在肝癌患者组织中NAP1L1的高表达提示着患者的不良预后。因此，进一步的研究NAP1L1在肝癌发生发展中的机制，有助于为今后肝癌的个体化治疗提供理论基础。

[1] Simon HU,Mills GB,Kozlowski M,et al.Molecular characterization of hNRP,a cDNA encoding a human nucleosome-assembly-protein-I-related gene product involved in the induction of cell proliferation〔J〕.Biochem J,1994,297 (Pt 2):389-397.

[2] Attia M,Rachez C,Avner P,et al.Nucleosome assembly p-

roteins and their interacting proteins in neuronal differentiation〔J〕.Arch Biochem Biophys,2013,534(1-2):20-26.

[3] Shen HH,Huang AM,Hoheisel J,et al.Identification and characterization of a SET/NAP protein encoded by a brain-specific gene,MB20〔J〕.Genomics,2001,71(1):21-33.

[4] Smith RJ,Dean W,Konfortova G,et al.Identification of novel imprinted genes in a genome-wide screen for maternal methylation〔J〕.Genome Res,2003,13(4):558-569.

[5] Okuwaki M,Kato K,Nagata K.Functional characterization of human nucleosome assembly protein 1-like proteins as histone chaperones〔J〕.Genes Cells,2010,15(1):13-27.

[6] Nagata T,Takahashi Y,Ishii Y,et al.Profiling of genes differentially expressed between fetal liver and postnatal liver using high-density oligonucleotide DNA array〔J〕.Int J Mol Med,2003,11(6):713-721.

[7] Nagata T,Takahashi Y,Ishii Y,et al.Transcriptional profiling in hepatoblastomas using high-density oligonucleotide DNA array〔J〕.Cancer Genet Cytogenet,2003,145(2):152-160.

[8] Line A,Slucka Z,Stengrevics A,et al.Characterisation of tumour-associated antigens in colon cancer〔J〕.Cancer Immunol Immunother,2002,51(10):574-582.

[9] Kidd M,Modlin IM,Mane SM,et al.The role of genetic markers--NAP1L1,MAGE-D2,and MTA1--in defining small-intestinal carcinoid neoplasia〔J〕.Ann Surg Oncol,2006,13(2):253-262.

[10] Schimmack S,Taylor A,Lawrence B,et al.A mechanistic role for the chromatin modulator,NAP1L1,in pancreatic neuroendocrine neoplasm proliferation and metastases〔J〕.Epigenetics Chromatin,2014,7:15.

[11] Kamiyama T,Nakanishi K,Yokoo H,et al.Recurrence patterns after hepatectomy of hepatocellular carcinoma:implication of Milan criteria utilization〔J〕.Ann Surg Oncol,2009,16(6):1560-1571.

[12] Imamura H,Matsuyama Y,Tanaka E,et al.Risk factors co-

ntributing to early and late phase intrahepatic recurrence of hepatocellular carcinoma after hepatectomy〔J〕.J Hepatol,2003,38(2):200-207.

[13] Park Y-J,Luger K.Structure and function of nucleosome assembly proteinsThis paper is one of a selection of papers published in this Special Issue,entitled 27th International West Coast Chromatin and Chromosome Conference,and has undergone the Journal's usual peer review process〔J〕.Biochem Cell Biol,2006,84(4):549.

[14] Gong H,Yan Y,Fang B,et al.Knockdown of nucleosome assembly protein 1-like 1 induces mesoderm formation and cardiomyogenesis via notch signaling in murine-induced pluripotent stem cells〔J〕.Stem cells，2014,32(7):1759-1773.

(编辑：吴小红)

Expression of NAP1L1 in Primary Hepatocellular Carcinoma and Its Clinical Significance

LEYong,OUYANGHanyue,ZHANGYongfa,etal.

SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou,510060

Objective To explore the expression of NAP1L1 in resectable human hepatocellular carcinoma (HCC).Methods Expression of NAP1L1 in 173 cases of HCC tissues and adjacent-tumor tissues were detected by immunohistochemistry (IHC) method.Results The expression of NAP1L1 in adjacent-tumor tissues was totally negative,while the expression of NAP1L1 of HCC tissues was highly-expressed and the positive rate was 28.32%..The expression level of NAP1L1 was significantly correlated with the level of AFP and cirrhosis.Conclusion Overexpression of NAP1L1 in HCC indicates the patients' poor prognosis.The expression of NAP1L1 may play a certain role in the occurrence and development of liver cancer.

Hepatocellular carcinoma(HCC);NAP1L1;Prognosis

国家自然科学基金项目(编号：81272639)；中山大学5010计划项目(编号：2007043)

510060 中山大学肿瘤防治中心

石 明

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.001

R735.7

A

1001-5930(2016)11-1741-03

2015-12-07

2016-08-20)