鸡SP-A在293T细胞中的表达及免疫学检测

黄 琪，汪 凯，涂 健，潘 玲，祁克宗，李泽君，陈鸿军，刘红梅

（1. 安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·研究论文·

鸡SP-A在293T细胞中的表达及免疫学检测

黄 琪1,2，汪 凯1,2，涂 健1，潘 玲1，祁克宗1，李泽君2，陈鸿军2，刘红梅1

（1. 安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

为表达鸡肺表面活性蛋白A（chicken palmonary surfactant protein A，cSP-A）基因，本研究扩增去除终止子的cSP-A，通过Nhe I和Apa I双酶切，连接进入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A中，构建获得重组载体pcSP-A；同时，将cSP-A和gfp基因按Nhe I-BamH I和BamH I-Apa I分别连接至pcDNA3.1/myc-His(-)A载体中，构建获得融合表达载体pcSP-A-GFP。通过脂质体法将这两类真核载体瞬时转染293T细胞，48 h 4%多聚甲醛固定细胞，利用cSP-A特异性鼠多抗进行间接免疫荧光，于倒置荧光显微镜下观察cSP-A表达和亚细胞定位情况，然后收获细胞进行Western blot检测。结果发现，cSP-A在细胞质中表达，pcSP-A和pcSP-A-GFP融合蛋白的相对分子量分别约为30 kDa和55 kDa。上述研究结果为进一步研究cSP-A的功能奠定了基础。

鸡肺表面活性蛋白A；真核表达；检测

先天性免疫防御系统是机体抵抗病原体入侵的第一道防线。先天性免疫反应的主要特征为细胞吞噬、溶菌作用、免疫调节以及模式识别[1]。凝集素属于可溶性的模式识别受体，存在于动物不同的组织中，与不同的微生物表面的多糖相互作用。鸡肺表面活性蛋白A（chicken surfactant protein-A，cSP-A）是鸡肺泡上皮分泌的一种亲水性糖蛋白。与大多数哺乳动物相似，成熟的cSP-A单体从N端到C端依次为5个结构域：短的N-端区、N-末端胶原样结构域（collagen-like region，CLR）、未知区、茎区和C-末端的凝集素糖识别结构域（carbohydrate-recognition domain，CRD），属于钙依赖型凝集素（C-type lectin）[2]。研究表明，哺乳动物SP-A主要分布于呼吸道、消化道、肾脏、膀胱、睾丸，胸腺、脾脏等[3]。cSP-A蛋白的组织分布与哺乳动物是否一致尚不清楚。SP-A能够通过凝集或者聚合作用来刺激吞噬细胞进行清除或杀死多种病原微生物[4]。Reemers等[5]发现禽流感病毒感染后，气管中cSP-A的mRNA表达上调，在肺脏中表达下调，表明cSP-A可能在先天免疫系统中发挥重要作用。

本研究室前期尝试从鸡肺脏灌洗液中提取并纯化蛋白，但未得到高质量的纯化蛋白，且纯化成本较高，原核表达产物也没有明显抑菌效果。为制备有生物活性的SP-A重组蛋白，本研究利用真核表达系统表达cSP-A，以期为进一步研究cSP-A功能与临床应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1 细胞、菌株及载体 HEK-293T细胞由本实验室保存，用含10%胎牛血清的Opti-MEM培养基（购自美国Gibco公司）培养；大肠杆菌工程菌DH5α感受态购自美国Invitrogen公司；pcDNA3．1/myc-His（-）A、pEGFP-C1载体由本实验室保存；pCold-cSP-A载体由本实验室构建，将cSP-A基因克隆至原核表达pCold-TF载体（购自大连宝生物公司）中。

1.2 试剂 凝胶回收试剂盒及质粒小量和中量提取纯化试剂盒购自德国Qiagen公司；T4 DNA连接酶、Nhe I、BamH I、Apa I等限制性内切酶购自英国NEB公司；ECL显色发光试剂盒购自美国热电公司；TransIT®-293转染试剂购自美国Mirus公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自美国Molecular Probe公司。

1.3 抗体 HRP标记羊抗鼠IgG购自美国Santa Cruz公司；Fluor®594标记羊抗鼠IgG（H+L）购自美国Invitrogen公司；利用pCold-cSP-A进行原核表达，将纯化产物作为免疫原，包裹弗氏佐剂经腹腔注射6周龄Balb/c小鼠（100 μg/只），7 d后加强免疫1次，随后再隔7 d后追加免疫纯化抗原（100 μg/只），5 d后采集血液，分离血清备用。

1.4 引物设计与合成 根据GenBank中鸡SP-A基因核苷酸序列（登录号：AF411083），利用Lasergene 10设计两对引物，同时在cSP-A的C端融合绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因，设计引物序列如下（表1），下划线标记的为酶切位点。

表1　本研究中引物设计Table 1 Primers for amplifi cation in this study

1.5cSP-A成熟肽PCR扩增 以pCold-cSP-A质粒为模板，以P1、P2引物和P1、P3引物，分别扩增不同酶切位点的去除终止密码子cSP-A基因片段cSP-A1和cSP-A2。热循环条件：95℃预变性5 min；94℃变性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物进行DNA电泳检测，回收纯化目的条带，-20℃储存备用。

1.6 pcSP-A真核表达载体构建 对cSP-A1的PCR产物及pcDNA3．1/myc-His(-)A载体分别用限制性内切酶Nhe I和Apa I进行双酶切。胶回收目的基因片段，经T4 DNA连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌感受态菌DH5α，PCR鉴定为阳性克隆后，送苏州金唯智公司测序，测序正确的阳性质粒命名为pcSP-A。

1.7 pcSP-A-GFP真核表达载体构建 用限制性内切酶Nhe I和Bam H I分别对cSP-A PCR产物及pcDNA3．1/ myc-His(-)A载体双酶切，回收、连接、转化，构建pcSPA-NB重组载体；利用pEGFP-C1载体作为模板，扩增GFP基因（gfp），将重组载体pcSP-ANB和gfp PCR产物分别用BamH I和Apa I双酶切，回收、连接、转化，挑取阳性克隆提取质粒，送苏州金唯智公司测序，测序正确的阳性质粒命名为pcSPA-GFP。

1.8 重组真核表达质粒转染293T细胞 用含10%小牛血清的Opti-MEM培养基培养293T细胞，转染前12 h消化细胞，接种至6孔板中。分别将1μg pcSP-A和pcSP-A-GFP，溶于500 μL无抗性无血清的Opti-MEM培养液中，加入2 μL TransIT®-293转染试剂，振荡混匀，室温孵育30 min，加至6孔板，同时设空质粒和pEGFP-C1做对照。37℃、5% CO2培养4～6 h后，更换培养基，继续培养48 h。

1.9 利用间接免疫荧光试验（indirect immunoflu orescence assay，IFA）进行亚细胞定位 pcSP-AGFP和pcSP-A质粒转染48 h后，4%多聚甲醛固定293T细胞10 min，用0．2% Triton X-100的PBS溶液渗透2 min，以1:100稀释的cSP-A多抗为一抗，Fluor®594标记羊抗鼠IgG（H+L）（1:500）为二抗，同时用DAPI染细胞核，IFA检测cSP-A的表达情况及亚细胞定位。

1.10 Western blot分析 分别收集转染pcSP-A-GFP和pcSP-A质粒的293T细胞及上清液，加入2×loading buffer，经12% SDS-PAGE分离后，转印至NC膜；5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，0．1mol/L TBST洗涤15 min后，以1:1000稀释的抗cSP-A单抗为一抗，室温孵育2～4 h；TBST洗膜3次，每次10 min，以1:5000稀释的HPR标记的羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min，用化学发光试剂盒（ECL）进行显色，在天能发光成像系统中成像分析。

2　结果

2.1 cSP-A蛋白真核表达载体构建 以真核表达载体pcSP-A为模板，PCR扩增均得到666 bp的目的条带（图1A），以真核表达载体pcSP-A-GFP为模板的PCR扩增产物电泳后也得到666 bp的目的条带，与预期相符（图1B）。测序结果表明cSP-A真核表达载体构建成功。

2.2 SP-A基因在293T细胞中的表达及亚细胞定位pEGFP-C1空载体和pcSP-A-GFP重组质粒同样条件转染293T细胞，转染24～48 h，荧光倒置显微镜下进行观察可见绿色荧光主要分布在细胞质中（图2A），表明融合蛋白cSP-A-GFP已经成功在293T细胞中获得表达，且主要在细胞质或细胞膜表面表达。用DAPI染细胞核，以cSP-A单抗为一抗进行IFA检测，结果与此相符，红色荧光均在细胞质或细胞膜表面（图2B）。对荧光表达结果、IFA结果以及核染结果（图2C）进行Merge，结果如图2D所示，而对照组中绿色荧光分布整个细胞（图2E），且免疫组化没有红色荧光表达（图2F）。同样方法转染质粒pcSP-A，IFA结果显示红色荧光也主要在细胞质或细胞膜表面（图3A，图3B），而空质粒pcDNA3．1（-）则无红色荧光表达（图3C，图3D）。

2.3 Western blot分析 分别收集转染pcSP-A-GFP和pcSP-A质粒的细胞及上清，用抗cSP-A-CRD小鼠多抗血清进行Western blot检测。结果显示细胞上清组没有出现特异性条带，而pcSP-A-GFP的细胞裂解产物在分子量约为55 kDa处出现特异性的杂交条带（图4），pcSPA的细胞裂解产物在分子量约为30 kDa处出现特异性的杂交条带（图4）。根据理论计算，cSP-A分子量约为24 kDa，由于它还有一个潜在的N-糖基化位点，所以Western blot显示分子量大于其理论值。而空载体对照未见特异性条带，表明cSP-A基因在293T细胞中表达。

图1　cSP-A 基因PCR扩增结果Fig. 1 PCR analysis of cSP-A gene

图2　pcSP-A-GFP重组质粒的间接免疫荧光试验鉴定Fig. 2 Identifi cation of the pcSP-A-GFP recombinant plasmid by indirect immunofl uorescence assay（IFA）

图3　pcSP-A重组质粒的间接免疫荧光试验鉴定Fig. 3 Identifi cation of the pcSP-A recombinant plasmid by immunofl uorescence assay（IFA）

图4　重组cSP-A蛋白的Western blot检测Fig. 4 Detection of the recombinant cSP-A protein by Western blot analysis

3　讨论

禽类防御系统主要包括非特异性免疫反应和特异性免疫反应，特异性免疫反应的建立需要一定的时间，因此，研究非特异性天然防御活性物质对降低家禽的呼吸系统疾病有着重要意义。SP-A在肺表面活性物质相关蛋白中含量最丰富。作为一类天然免疫分子，SP-A依靠其CRD识别多种微生物糖基[6]，又借其CLR与吞噬细胞表明的ClqR结合，从而调理吞噬作用[7]，此外，SP-A的Neck区和CRD区可以识别流感病毒的血凝素，使流感病毒聚集，以降低其感染性[8]。

SP-A的来源主要是天然提取和基因工程合成。天然提取SP-A在结构和活性的完整性方面优于基因工程合成，由于取材困难，国外学者多采用maltose-agarose亲和层析及Superose-6凝胶过滤[9]，而Superose-6凝胶过滤柱价格高昂，使天然提取方法的应用受到限制，国内目前尚无提取鸡SP-A的文献报道。有研究人员尝试用原核表达系统，pCold-TF表达载体对cSP-A成熟肽进行原核表达，得到高效表达的可溶性蛋白，但抑菌试验证明该蛋白并没有明显抑菌功能，这可能由于原核产物没有天然蛋白的翻译后修饰，也不能形成三聚体，从而不能发挥生物活性[10]。

为制备具有生物活性的SP-A重组蛋白，本研究构建了pcSP-A-GFP重组真核表达载体，并在C端融合了His标签，以便于通过His-Bind琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中纯化cSP-A重组蛋白。pcSP-AGFP载体表达的融合蛋白具有cSP-A和GFP的双重特性，可用gfp作为报告基因观察cSP-A的表达与定位。考虑到GFP对cSP-A蛋白活性可能造成影响，同时构建了pcSP-A载体。目前融合蛋白主要在细胞中表达，并没有分泌到上清，下一步计划构建SP-A基因的真核分泌性表达载体pCD5-cSP-A，对表达产物进行亲合层析纯化，利用纯化的蛋白进行病毒抑制试验在体内外研究cSP-A的功能，为脏肺表面活性物质制剂研发奠定基础。

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EUKARYOTIC EXPRESSION AND IMMUNOLOGICAL ASSAYS OF CHICKEN PULMONARY SURFACTANT PROTEIN A IN 293T CELLS

HUANG Qi1,2, WANG Kai1,2, TU Jian1, PAN Ling1, QI Ke-zong1, LI Ze-jun2, CHEN Hong-jun2, LIU Hong-mei1
(1. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Chicken pulmonary surfactant protein A (cSP-A) gene was amplifi ed without the stop codon and subcloned into pcDNA3.1/ myc-His (-) A vector with Nhe I and Apa I for expression in eukaryotic system. The resulting plasmid pcSPA was subsequently linked with the green fl uorescence protein (GFP) gene into pcDNA3.1/myc-His (-) A vector with Nhe I/BamH I and BamH I/Apa I sites to construct a recombinant eukaryotic expression vector pcSP-A-GFP. The pcSPA-GFP plasmids were then transfected into 293T cells by TransIT-293 reagent. The sublocalization of cSP-A protein was detected using indirect immunofl uorescence assay (IFA) with the specifi c antibody against cSP-A. The expressed fusion protein was identifi ed in Western blot. Expression of cSP-A was visualized in cytoplasms of the transfected 293T cells. The relative molecular mass of the fusion proteins pcSP-A-GFP and pcSP-A were about 55 kDa and 30 kDa, respectively. The biological activities of cSP-A expressed in the eukaryotic system will be investigated in the future study.

Chicken SP-A; eukaryotic expression; detection

S852.42

A

1674-6422（2016）05-0063-06

2016-03-07

安徽省自然科学基金（1408085MC49）

黄琪，女，硕士研究生，基础兽医学专业

刘红梅，E-mail：1030775529@qq．com；陈鸿军，E-mail：vetchj@shvri．ac．cn