胶体金免疫层析技术及其在动物疾病诊断中的应用

柳旭伟，葛文霞，张文举，杨力伟

（1.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；2.新疆农业职业技术学院动物科技学院，昌吉 831100）

·综述·

胶体金免疫层析技术及其在动物疾病诊断中的应用

柳旭伟1,2，葛文霞1,2，张文举1，杨力伟2

（1.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；2.新疆农业职业技术学院动物科技学院，昌吉 831100）

胶体金免疫层析技术是一种新型的固相免疫标记检测技术，因其生产成本低、操作简单、检测范围广、安全性好等诸多优点，使其在动物疾病诊断、早孕检测、药物残留和重金属检测等方面被广泛应用。近年来，国内外学者多胶体金免疫层析技术的研究越来越多，文章就胶体金免疫层析技术的原理、分类、特点以及在动物疾病诊断中的应用的最新研究进展进行了综述，分析了其存在的缺点以及未来的发展方向等。

胶体金；免疫层析；动物疾病；诊断；应用

胶体金免疫层析（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）技术是以胶体金作为标记物检测特定抗体或抗原的一种新型的固相免疫标记技术。GICA技术将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种检测方法有机地结合在了一起，是继荧光素、酶标记和放射性同位素技术之后的又一重要的新型免疫标记技术。目前，GICA技术已被广泛应用于妊娠检测、病原体抗体或抗原检测、疾病相关的蛋白检测等。虽然GICA技术在动物疾病诊断上的应用起步较晚，但发展十分迅速，GICA技术已经成为目前动物医学快速检测中最快速、敏感的免疫学检测方法之一。由于该技术具有操作简便、特异、灵敏和快速等优点，因此特别适合广大的基层兽医人员使用，适用于大批量检测以及大面积普查等，具有广阔的应用前景和巨大的发展潜力。本文主要介绍了GICA技术的原理、分类、特点以及在动物疾病诊断中的应用等。

1　GICA技术及其原理

1.1 胶体金 胶体金又叫金溶胶，是氯金酸在还原剂如硼氢化钠、白磷、过氧化氢、乙醇、鞣酸、枸橼酸钠、抗坏血酸等的作用下，聚合成特定大小的金颗粒。金颗粒在碱性溶液中其表面带有负电荷，金颗粒之间的静电排斥力使在溶液中形成稳定的胶体。如果溶液中存在较大的分子，比如蛋白质分子时，蛋白质分子表面的正电荷就会与金颗粒表面的负电荷结合，蛋白质分子上就会吸附金颗粒，并且蛋白质的生物活性依然不会受到影响[1]。胶体金溶液会随着溶液浓度的升高其颜色将由桔红色变为紫红色。正是由于胶体金具有化学性质稳定、能够吸附以及颜色变化的特性，使得胶体金具备了成为检测标记物的特点。

1.2 胶体金免疫技术 胶体金免疫技术是以胶体金作为检测标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫检测技术。主要利用了金颗粒的高电子、高密度特性，在显微镜下可见金标蛋白结合处有黑褐色的颗粒，当这些标记物大量聚集在相应的配体处时，呈现出肉眼可见的粉红色或红色斑点，因而被用于定性或半定量的快速免疫检测中。

1.3 胶体金免疫层析技术 GICA技术是将胶体金标记技术、免疫检测技术以及层析分析技术等多种检测方法有机结合在一起的一种固相标记免疫检测技术。其原理是以条状纤维层析材料为固相，将已知的特异性抗原（或抗体）固定于膜的某一区带（检测带），胶体金标记物干燥在玻璃纤维的结合释放垫上，一端与膜相连，另一端与样品垫相连，膜的另一端连有吸水垫[2]。检测时，在样品垫处加入待检样品（血清、全血、尿或其它体液）后，样品将沿层析方向向前移动，样品中的待检物会与层析材料上针对该待检物的受体（抗原或抗体）结合，发生高亲和性和高特异性的免疫反应。层析过程中，形成的免疫复合物将被截留或富集在检测带上，标记物（胶体金）会呈现直观的显色试验现象。若样品中不含待检物，则会同游离标记物一起到达控制线（图1）[3-5]。

图1　胶体金免疫层析试纸条构造图Fig. 1 Construction of colloidal gold immunochromatography assay test paper

2　GICA技术的分类

GICA技术既可以检测抗原又可以检测抗体，主要有：间接法、竞争法和夹心法，其中夹心法又分为双抗原夹心法和双抗体夹心法。

2.1 间接法 间接法一般用于抗体的检测，其胶体金垫用待测抗体的多克隆抗体进行包被，检测线（T线）用待测抗体的抗原蛋白进行包被，控制线（C线）用金标抗体的二抗进行包被。如一个阳性样本进行检测，样品中的抗体先与胶体金垫中的多克隆抗体结合，经过检测线时与检测线上包被的抗原蛋白结合并不断累积胶体金并显色。多余的金标多克隆抗体继续前行与质控线上包被的金标抗体的二抗结合，不断累积并显色。T线和C线均显色为阳性，T线不显色、C线显色为阴性，T线和C线均不显色为无效。

2.2 竞争法 竞争法经常用来检测小分子抗原，其胶体金垫上吸附的金标抗原或抗体和待测物与检测线（T线）上包被的抗体或抗原进行竞争性结合。如一个阳性样本进行检测，待测物中的抗体与检测线包被的抗体可竞争性结合金标抗原表面有限的抗原位点。随着待测物的增多，待测物与金标抗原结合越多，便导致检测线上包被的抗体无法和金标抗原结合，则检测线（T线）无法显色。而质控线（C线）上的二抗与抗原却不存在竞争关系，金标抗原层析到质控线时与二抗结合并不断累积而显色。与间接法结果不同的是，T线和C线均显色为阴性，T线不显色、C线显色为阳性，T线和C线均不显色为无效。

2.3 双抗体夹心法 常用来检测抗原样本，胶体金垫用待测物的单克隆抗体包被，检测线（T线）用针对待测物另一位点的单克隆抗体包被，控制线（C线）用金标抗体的二抗进行包被。如一个阳性样本进行检测，待测物同时与金标抗体和检测线单抗结合形成一个双抗体夹心待测物（抗原）的大分子，这个大分子在检测线上聚集并显色，多余的金标抗体继续层析至控制线并与其包被的二抗结合而显色。T线和C线均显色为阳性，T线不显色、C线显色为阴性，T线和C线均不显色为无效。

双抗原夹心法与双抗体夹心法的原理基本一致，只是胶体金垫和检测线（T线）用已知的抗原进行包被，主要用来进行抗体的检测。

3　GICA技术的特点

3.1 GICA技术的优点

3.1.1 生产成本低 试纸结构较为简单，耗材和生产设备等成本较低，相对易于制造和大批量生产，生产成本低。

3.1.2 操作简单 GICA技术检测样本不需要特殊处理，不需要特殊仪器设备，操作简单，可用肉眼直接判断检测结果，基层工作人员均可操作。

3.1.3 检测范围广 GICA技术可用于抗原和抗体的检测，目前被广泛应用于妊娠检测、病原体抗体或抗原检测、疾病相关的蛋白检测等，可检测全血、血浆、血清、唾液、尿、体液等样品。

3.1.4 灵敏快速 应用高质量的单克隆抗体，检测分析下限可达到10 pg，灵敏度可以超过ELISA。一般情况下，应用PCR技术检测需3～4 h，ELISA需1～2 h才能出结果，而GICA技术一般只需5～10 min，检测时间大大减少，是目前其他检测方法达不到的。

3.1.5 特异性高 一般用单克隆抗体标记胶体金，对组织细胞的非特异性吸附作用较小，因此具有较高的特异性。

3.1.6 安全性好 与其他检测方法相比，GICA技术没有邻苯二胺、放射性同位素等有害物质，所以既不会污染环境，也不会污染操作人员的健康，安全性好。

3.1.7 稳定方便 GICA试纸往往不需要冷藏，保质期可达12～24个月。由于胶体金标记蛋白质是一个物理结合过程，结合十分牢固，极少引起蛋白质生物活性的改变，所以试剂十分稳定，不易受到外界温度等环境因素的影响，可以随身携带并随时检测，因而使用方便。

3.2 GICA技术的缺点 虽然GICA技术具有众多的优点，但是与其他检测方法相比，仍然具有特异性和灵敏度低、假阳性和假阴性率高等缺点，还不能较好的实现定量检测。

4　GICA技术在动物疾病诊断中的应用

4.1 GICA技术在细菌性疾病诊断中的应用

4.1.1 猪链球菌 Ju等[6]研制出了检测猪2型链球菌的GICA试纸条，其灵敏度高达106CFU/mL，并与其他血清型（除SS1/2型以外）链球菌无交叉反应，10 min即可检测出结果。

4.1.2 沙门氏菌 Moongkarndi等[7]研制了快速检测肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的GICA试纸条，该试纸条能够快速检测培养基中的肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，检测灵敏度为106CFU/mL和104CFU/ mL。临床检测结果表明，该试纸条检测肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的敏感性分别为87．50%和98．89%。与商业化的检测方法相比，特异性为100%，是首个能同时检测两种不同的沙门氏菌的胶体金方法，为养鸡场以及其它肉制品进行肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的大批量检测提供了一种快速、简单、特异性高的检测手段[8]。

4.1.3 野兔热土拉杆菌 Kilic等[9]研制了检测野兔热土拉杆菌的GICA试纸条，该方法的特异性和敏感性分别为94．6%和99．3%，在检测正常血清样品，自身免疫性疾病及细菌、病毒和寄生虫感染的血清学样品时均无交叉反应。

4.1.4 金黄色葡萄球菌 刘洪贵等[10]建立了一种双抗体夹心法GICA试纸条用于金黄色葡萄球菌的快速检测，结果表明，该试纸条的敏感性为104CFU/mL，与链球菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、芽孢杆菌和李氏杆菌均无交叉反应，特异性较好。布日额等[11]研制出了致奶牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌GICA试纸条，检测结果表明，该试纸条具有较好的敏感性、特异性和稳定性。

4.1.5 大肠杆菌 高成秀[12]制备了大肠杆菌O157和Stx2双抗体夹心试纸条，可同时检测大肠杆菌O157抗原以及Stx2毒素，检测结果表明，大肠杆菌O157试纸条的敏感性、特异性和重复性较好，但Stx2试纸条的重复性和阳性检测率还有待进一步的提高。孙洋等[13]以兔抗O157多克隆抗体包被于硝酸纤维素膜作为捕获抗体，以肠出血性大肠埃希菌O157单克隆抗体为标记探针，制成双抗夹心O157GICA试纸条，该试纸条与其他菌株均不反应，仅与O157反应，特异性强、操作简便、检测速度快、敏感性高，可用于大量样品的现场检测。

4.1.6 结核分枝杆菌 Soo等[14]研制了检测结核分枝杆菌的GICA试纸条，临床试验证实，该方法快速、简便、具有良好的敏感性和特异性。冯向辉等[15]建立的了牛结核分枝杆菌GICA快速诊断法，所研制的试纸条不与牛巴贝斯病、牛副结核、牛传染性鼻气管炎病和口蹄疫阳性血清作用，具有较好的特异性。Wassie等[16]和Mduli等[17]建立了检测人结核分枝杆菌的GICA快速诊断法，研制的试纸条具有较好的检测效果。

4.1.7 布鲁氏菌 朱明东等[18]所研制的诊断布鲁菌病的GICA试纸条，通过采用不同血清的用量来确定试纸条的特异性和敏感性，特异性和敏感性分别达到97．3%和91．3%，具有特异、敏感、操作简便、血清用量少等特点，更适合于布鲁菌病的诊断、流行病学调查及现场应用。

4.2 GICA技术在病毒性疾病诊断中的应用

4.2.1 口蹄疫病毒 Jiang等[19]建立了检测FMDV的双抗体夹心GICA法，该方法的检测灵敏度为11．7 ng/ mL，15 min即可得出结果。Yang等[20]还研制了一种基于合成肽技术的GICA试纸条，该试纸条能够区别O型FMDV感染猪与疫苗免疫猪。蒋韬等[21]建立了检测O型、A型和AsiaⅠ型FMDV的定型诊断GICA方法。林彤等[22]建立的AsiaⅠ型FMDV的胶体金试纸条，不与猪水疱病病毒以及FMDV的其他血清型发生交叉反应，有较好的特异性，该试纸条与其他传统诊断方法的符合率达98．8%。

4.2.2 猪圆环病毒 Jin等[23]采用重组核衣壳蛋白作为检测抗原，建立了检测猪圆环病毒2型的GICA方法，研究结果表明，该方法具有良好的敏感性和特异性。王慧杰等[24]用猪圆环病毒2型重组Cap蛋白，研制了检测猪圆环病毒2型Cap抗体的GICA试纸条，检测来自不同猪场的165份送检血清，其结果与间接免疫荧光符合率在85%以上。

4.2.3 猪瘟病毒 Li等[25]用纯化的嵌合蛋白（CnC2）为抗原建立了检测猪瘟血清中猪瘟病毒疫苗抗体滴度的GICA试纸条，该试纸条与商业化的ELISA试剂盒的检测符合率为93．5%，特异性和敏感性分别为100%和97%。郑鸣等[26]用胶体金分别标记猪瘟强毒和弱毒抗原，用双抗原夹心法建立了区分猪瘟强毒和弱毒抗体的GICA试纸条，该方法特异性好、灵敏度高、操作简单，能区分强毒和弱毒感染，适合猪瘟的临床诊断。

4.2.4 轮状病毒 刘兆磊等[27]研制的A群猪轮状病毒GICA试纸条的最低检测限为1:32稀释的病毒培养液。该试纸条具有较好的特异性，与猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒无交叉反应，且不同批次试纸条的重复检测结果一致。

4.2.5 禽流感病毒 Cui等[28]研制出了检测H5亚型禽流感病毒抗体的GICA试纸条，特异性和敏感性分别为97．6%和88．8%。彭伏虎等[29,30]在研制的H9亚型禽流感病毒GICA检测方法的基础上组装了试剂盒，可在室温下保存6个月，4℃保存12个月，在10 min内即可准确检测出结果，准确率可达到100%。徐一鸣等[31]建立了针对H3和H7亚型禽流感病毒的GICA试纸条，其与H5和H9亚型AIV标准抗原、病料以及新城疫抗原、传染性支气管炎均无交叉反应，具有较好的特异性。

4.2.6 新城疫病毒 李希友等[32]用胶体金标记NDV抗原，兔抗NDV抗体和NDV抗原分别包被到检测线和质控线上，研制出了半定量GICA试纸条用于快速测定新城疫抗体。

4.2.7 犬瘟热病毒 Oh等[33]研制出了检测犬瘟热病毒抗体的GICA试纸条，通过386份临床样品检测试验，可知GICA相对于血凝抑制试验的特异性为76．6%，敏感性为97．1%。

4.2.8狂犬病毒 Joon等[34]建立了GICA试纸条用于检测伪狂犬病病毒，样品仅需25 μL，5 min即可检测出，与其他常见猪病无交叉反应。

4.2.9 其它 近几年，国内外的学者还研制了一些检测其它病毒的GICA试纸条。Kameyama等[35]研制了GICA试纸条用于快速检测BVDV抗原。王翌等[36]建立了检测鹅副粘病毒胶体金试纸条，该试纸条可以检测出血凝价24以上的鹅副粘病毒尿囊液。Sheng等[37]建立了检测鱼淋巴囊肿病毒GICA试纸条，其灵敏度为1 μg/mL，稳定性也较好。

4.3 GICA技术在寄生虫病诊断中的应用

4.3.1 弓形虫 卓国荣等[38]发明的检测犬弓形虫的GICA试纸条与IHA试剂盒的符合率为99%。检测人工感染弓形虫的犬血清，两者符合率高达100%。

4.3.2 旋毛虫 秦银霞等[39]研制的免疫层析试纸条，通过检测旋毛虫患者以及旋毛虫感染的大鼠、小鼠、猪和兔的阳性血清，除了小鼠的检出率为97．87%外，其余均为100%。

4.3.3 猪带绦虫 张少华等[40]研制的检测猪带绦虫GICA试纸条，以胶体金标记猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组蛋白抗原，与全囊虫抗原ELISA的相对特异性和敏感性分别为95．2%和75．0%，和剖检计数法的相对敏感性为80．0%，并具有较好的稳定性。

4.3.4 其他 近年来，国内外的学者还研制了一些检测诸如血吸虫、新孢子虫的GICA试纸条，并取得了较好的检测结果，开始应用于生产。

5　展望

GICA技术生产成本低、操作简单、检测范围广、安全性好等诸多优点，使得该技术成为多种领域应用与研究的热点，相关研究不断深化，检测范围不断拓宽。国内外学者一直在进行GICA技术对动物疾病检测的研究，使其成为得基层广大兽医工作利用一种可靠的技术手段，对动物疾病进行快速诊断成为了可能。但是由于GICA技术存在诸多的不足，今后可在以下几个方面需加强研究。

5.1 定量检测 目前应用于生产的GICA试纸条多数都用于进行定性检测，半定量检测也只是少数几种，主要通过肉眼观察颜色的变化判定结果，初略检测。但是定量检测能够给疾病的诊断带来更多的帮助，所以加强对定量GICA试纸条的研究是未来的一个重要方向，具有十分重要的意义。

5.2 提高灵敏度 GICA技术同样存在检测的特异性和灵敏度低、假阳性和假阴性率高的问题，最终疾病的确诊还需借助其它的诊断方法和手段，造成了诊断时间的延长和成本的增加，这给实际生产应用中带来了非常大的麻烦。因此，提高GICA试纸条的灵敏度也是将来研究的重点。

5.3 多样本检测 目前应用于生产的GICA试纸条大多数只能检测一个样本，主要针对一种疾病，这样会造成重复采样、重复检测，同时延长疾病诊断的时间，并增加检测成本。研究可应用于多种疾病的GICA试纸条也是未来的重要发展方向。

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APPLICATION OF COllOIDAL-GOLD IMMUNOCHROMATOGRAPHY ASSAY (GICA) TO DIAGNOSTICS OF ANIMAL DISEASES

LIU Xu-wei1,2, GE Wen-xia1,2, ZHANG Wen-ju1, YANG Li-wei2
(1.College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, China; 2.College of Animal Science and Technology, Xinjiang Agricultural Vocational and Technical College, Changji 831100, China)

Colloidal gold immunochromatography assay (GICA) is a solid phase immune labeling technique. Because of its low production cost, simple operation, wide detection range and good safety, GICA has been widely used in the diagnosis of animal diseases, early pregnancy testing, drug residues and heavy metal detection. In recent years, domestic and foreign scholars have conducted a number of studies on the colloidal GICA technology. This article reviewed the principle, classifi cation, characteristics and latest research progress of colloidal GICA technology as well as its shortcomings and future study.

Colloidal gold; immunoassay; animal disease; diagnosis; application

S852.43

A

1674-6422（2016）05-0074-07

2015-12-24

公益性行业(农业)专项经费(201303062)；新疆农业职业技术学院科研基金项目（XJNZYKJ2014006）

柳旭伟，男，硕士研究生，预防兽医学专业

葛文霞，E-mail：gewenx9260@163．com