四种胃蝇三期幼虫的扫描电镜观察

杨红霞，斯 清，吴 辉，伊春阳，谢小婉，巴音查汗，郭庆勇

（1. 新疆农业大学，乌鲁木齐 830052；2. 昭苏县察汗乌松乡畜牧兽医站，昭苏 835604）

·研究论文·

四种胃蝇三期幼虫的扫描电镜观察

杨红霞1，斯 清2，吴 辉1，伊春阳1，谢小婉1，巴音查汗1，郭庆勇1

（1. 新疆农业大学，乌鲁木齐 830052；2. 昭苏县察汗乌松乡畜牧兽医站，昭苏 835604）

为准确掌握伊犁马四种胃蝇属三期幼虫的鉴别特征，本文以伊犁地区采集的马胃蝇蛆（n=200）为试验材料，借助体视显微镜、扫描电子显微镜对其进行形态学鉴定，并以各属蝇蛆每节排列刺的差异、形状、口钩及气门板等结构作为鉴定依据。结果显示，本次试验共鉴定出四种马胃蝇三期幼虫：兽胃蝇蛆、鼻胃蝇蛆、红尾胃蝇蛆、肠胃蝇蛆。超微观察可见鼻胃蝇三期幼虫第一胸段出现“隔板状”突出物、其刺列为单排刺列且胸部第一刺列为双排刺，此外鼻胃蝇三期幼虫口钩表面纹路差异较大且表面沟壑中有类似“纤毛状物”的存在；兽胃蝇三期幼虫背侧下颌骨部分扩展成叶且叶部的顶部为平滑状，其他三种胃蝇属三期幼虫叶部的顶端部位为锯齿状；红尾胃蝇形态学特征与肠胃蝇差异不显著，但其寄生部位与刺带特征可作为其鉴定依据。胃蝇属常见四种三期幼虫体表刺列、头部下颌骨叶部、口钩表面沟壑等均可作为其鉴别要点，为马胃蝇三期幼虫的鉴定提供参考依据。

马胃蝇三期幼虫；体视显微镜；扫描电子显微镜；鉴定

马胃蝇隶属于节肢动物门（Arthropod）、双翅目（Diptera）、环裂亚目（Cyclorrhapha）、胃蝇科（Gastrophilidae）、胃蝇属（Gasterophilus），其幼虫寄生于马属动物(马、驴和斑马等)胃肠道粘膜及胃贲门部，可引起骚乱不安、食欲减退及胃黏膜溃疡炎症[1]。马胃蝇病呈世界性分布，在摩洛哥[2]、埃及[3]、瑞典[4]、比利时[5]、波兰[6]、哈萨克斯坦[7]等地均有报道。我国多发生于西北、东北、内蒙古等地。新疆维吾尔自治区常见胃蝇属有4种，即兽胃蝇（Gasterophilus pecorum）、鼻胃蝇（Gasterophilus nasalis）、红尾胃蝇（Gasterophilus haemorrhoidalis）、肠胃蝇（Gasterophilus intestinalis），感染率高达100%[8]，死亡率达34．3%[9]，其幼虫利用身体棘刺和头部口钩附着在消化道内壁上，对胃部损伤面积可高达60%～80%[10]。

新疆维吾尔自治区（下文简称新疆）自古就以畜牧业而闻名，而伊犁哈萨克自治州（下文简称伊犁）又是我区养马业的重中之重。随着近年来马胃蝇蛆病的增多，死亡率也在逐年上升，严重影响了伊犁地区马产业的发展。目前，对于伊犁地区马胃蝇三期幼虫种类的鉴定及其相关的报道甚少。本研究采用体视显微镜的初步鉴定，进一步对伊犁常见的马胃蝇三期幼虫进行了超微结构鉴定，为该虫种的形态学鉴定提供参考依据。

1　材料与方法

1.1 虫体收集 从伊犁昭苏县病死马胃肠道器官（n1=148）与患病马粪（n2=52）中采集马胃蝇的第三期幼虫（兽胃蝇58只、鼻胃蝇44只、肠胃蝇37只、红尾胃蝇61只），生理盐水冲洗后将其保存在75%乙醇中，标注采集地点与采集时间。物种的识别基于胃肠道的位置与体视显微镜的初步鉴定。

1.2 主要仪器 日立（HITACHI）S-570型扫描电子显微镜；KQ-5200型单槽式超声波清洗机、ALPHA1-2型真空冷冻干燥仪（德国Christ 公司）、体视显微镜（MOTIC ST-39）。

1.3 方法

1.3.1 样品处理 用PBS缓冲液（pH=7．2）仔细清洗马胃蝇三期幼虫体表，再用超声波清洗60 min。将马胃蝇三期幼虫浸于PBS缓冲液，在体视显微镜下将马胃蝇三期幼虫第3、5、7腹节侧面轻刺3个小孔，依次转移到含有1．5%、2．5%、3．5%戊二醛固定液5 mL离心管中，室温下分别进行3、4、5 h的固定样品。再将马胃蝇三期幼虫样品放入真空冷冻干燥仪（真空度0．1 mbar，温度-42℃）进行干燥，将获得的马胃蝇三期幼虫样品，用导电胶带粘附于样品台上，进行喷金。马胃蝇三期幼虫样品全部背面喷金，进行扫描电镜观察。

1.3.2 鉴定方法 通过体视显微镜和文献[11,12]从外部结构特征进行分类鉴定。选取兽胃蝇、鼻胃蝇、红尾胃蝇、肠胃蝇三期幼虫各5只，进行扫描电子显微镜观察，重点观察比较口钩表面纹理、下颌骨等部位的特征。

2　结果

2.1 体视显微镜观察结果 在体视显微镜下对4种马胃蝇三期幼虫进行观察分类，其主要鉴别要点归纳见表1。

2.2 扫描电子显微镜观察结果 4种马胃蝇三期幼虫头胸部对比可见，鼻胃蝇头部延伸出“隔板状物”（图1B），而其他3种并未突出。鼻胃蝇上颌骨前头段突出，口钩向内弯曲且纵向平行虫体，以供其固定于宿主组织；触角神经叶位于背侧上颌骨，朝向外侧，头部探出时将其伸出背部上颌骨。

表1　兽胃蝇、鼻胃蝇、红尾胃蝇、肠胃蝇在体视显微镜下的鉴别要点Table 1 Morphological identifi cation of G.pecorum, G.nasalis, G.intestinalis and G.haemorrhoidalis under stereo microscopy

4种马胃蝇三期幼虫下颚具有显著差异，背侧下颌骨部分扩展成叶，鼻胃蝇、红尾胃蝇与肠胃蝇三期幼虫叶部的顶端部位为锯齿状，而兽胃蝇三期幼虫叶部的顶部为平滑状（图2B）。

4种马胃蝇三期幼虫第一胸段特点是存在完整的环状前沿小刺（图3），小刺出现在第二和第三的前沿胸段和腹部1～6段（图2）。兽胃蝇、红尾胃蝇与肠胃蝇的三期幼虫背腹部刺带为双排刺，外刺列均大于内刺列（图3C、D），鼻胃蝇三期幼虫形态特征为单排刺列，但在其胸部第一刺列为双排刺（图4）。

4种马胃蝇三期幼虫口钩可作为种类的鉴别特征（图5）。在鼻胃蝇的口钩外侧可见清晰且平行于口钩的纹路，口钩沟壑内长有类似于“纤毛”的物体且密度不一；其他3种马胃蝇三期幼虫表面光滑，其内侧口钩底部可见菱形纹路，口钩中部到尖端处为平行于口钩的沟壑，而其尖端为类似于鳞片叠加状沟壑，且无纤毛状结构（图6）。

图1　扫描电子显微镜的马胃蝇三期幼虫头胸部(50×)Fig. 1 The head and thorax of the third stage larvae of bots by scanning electron microscope (50×)

图2　扫描电子显微镜的马胃蝇三期幼虫下颚部(120×)Fig. 2 The mandible and thorax of the third stage larvae of bots by scanning electron microscope (120×)

图3　扫描电子显微镜的马胃蝇三期幼虫腹面刺带(20×)Fig. 3 Ventral spine zone of the third stage larvae of bots by scanning electron microscope (20×)

图4　鼻胃蝇三期幼虫腹面刺带（胸部第一刺列为双排刺，箭头所指，其余刺列为单排刺列）（20×）Fig. 4 Ventral spine zone of the third stage larvae of bots(The fi rst row of thorax is double which arrow indicates and the others are single row spines) (20×)

图5　扫描电子显微镜的马胃蝇三期幼虫口钩特征(120×)Fig. 5 The characteristics of mouth hooks by scanning electron microscope (120×)

3　讨论

图6　扫描电子显微镜的马胃蝇三期幼虫口钩表面(1000×)Fig. 6 The surface of mouth hook of bots by scanning electron microscope(1000×)

马胃蝇三期幼虫在马科动物消化道寄生，包括胃、十二指肠和直肠，但主要寄生在胃内，寄生时间大约持续10个月，易造成胃溃烂、肠阻塞、贫血、腹泻等问题，严重的可引起死亡。全世界已知的马胃蝇共有9种[12]，除了南方胃蝇、扁腹胃蝇、三列棘胃蝇，其他6种（兽胃蝇、鼻胃蝇、肠胃蝇、红尾胃蝇、黑角胃蝇和裸节胃蝇）在我国均有分布[13,14]。因此，对于其幼虫尤其是三期幼虫的研究显得尤为重要，但国内外这方面研究较少。期幼虫独一无二的特征，可能代表一个适应当地环境的特点[15]（如肠道能动性）。背侧部分的下颌骨部分扩展成叶，除兽胃蝇三期幼虫叶部的顶部为平滑状外，其他3种胃蝇属三期幼虫叶部的顶端部位为锯齿状。鼻胃蝇三期幼虫的体表刺列为单排刺列，但在其胸部第一刺列为双排刺。2007年Cowell等[15]对鼻胃蝇口钩表面纹路进行了对比，结果显示，可能由于地方差异，纹路差距较大。本研究拍摄过程中，放大口钩表面，发现鼻胃蝇三期幼虫的表面沟壑中有类似“纤毛状物”的存在，而在其他3种胃蝇属中并未发现。红尾胃蝇的形态学特征与肠胃蝇不易区分，在后期的研究中，希望通过更多的途径去区分。

背腹部刺列排布等传统的鉴定特征是马胃蝇三期幼虫鉴定的重要依据[11]，但由于个体与观察者视觉上存在差异，使马胃蝇三期幼虫在种类区分上存在争议。本研究以期通过扫描电子显微镜的观察，为该虫种的鉴定提供参考依据。

20世纪60年代中期扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）的出现，使人类观察微小物质的能力有了质的飞跃。在体视显微镜的观察中，有较多细微部分未能观察到，而扫描电子显微镜可以对虫体进行更加细微的观察，可以进行进一步区分。第一胸段的“隔板状”突出物是鼻胃蝇三

[1] 彭光政, 刘松, 刘兵, 等． 马胃蝇蛆病的防治措施[J]． 中国畜牧兽医文摘, 2011, 27(5), 99-100．

[2] Pandey V, Ouhelli H, Elkhalfane A． Observations on the epizootiology of gasterophilus-intestinalis and Gasterophilus nasalis in horses in morocco[J]． Vet Parasitol, 1980, 7(4): 347-356．

[3] Hilali M, Derhalli F S, Baraka A． Incidence and monthly prevalence of Gasterophilus spp． larvae (Diptera: Gasterophilidae) in the stomach of donkeys (Equus asinus) in Egypt[J]． Vet Parasitol, 1987, 23(3-4): 297-305．

[4] Agneessens J, Engelen S, Debever P, et al． Gasterophilus intestinalis infections in horses in Belgium[J]． Vet Parasitol, 1998, 77(2): 199-204．

[5] Hoglund J, Ljungstrom B, Nilsson O, et al． Occurrence of Gasterophilus intestinalis and some parasitic nematodes of horses in Sweden[J]． Acta Vet Scand, 1997, 38(2): 157-166．

[6] Studzinska M B, Wojcieszak K． Gasterophilus S P． Botfly larvae in horses from the South-eastern part of Poland [J]． B Vet Pulawy, 2009, 53(4): 651-655．

[7] Baltabek I, Lyudmila L, Christian B． Gasterophilus spp． infections in horses from northern and central Kazakhstan[J]． Vet Parasitol, 2015, 207(1-2): 94-98．

[8] 刘善辉． 马胃蝇形态学、流行病学调查及COI、16S r RNA 基因系统发育研究[D]． 北京: 北京林业大学, 2012．

[9] 杨四雄． 马胃蝇蛆病的诊疗[J]． 云南畜牧兽医, 2003, (1): 2．

[10] 杨健梅, 张东, 胡德夫, 等． 马胃蝇蛆病造成马体损伤性研究[J]． 中国畜牧兽医, 2013, 40(5): 177－180．

[11] 王善志, 徐显增． 新疆马胃蝇种类观察及其地理分布[J]．中国兽医科技, 1991, 21(11): 14-15．

[12] Zumpt F． Myiasis in Man and Animals in the Old World[M]． London: Butterworths, 1965: 267．

[13] 范滋德． 中国常见蝇类检索表[M]． 2版． 北京: 科学出版社, 1992: 890-895．

[14] 薛万琦, 赵建铭． 中国蝇类(下册)[M]． 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 1996: 2207-2217．

[15] Cowell D D, Otranto D, Horak I G． Comparative scanning electron microscopy of Gasterophilus third instars[J]． Med Vet Entomol, 2007, 27(3): 255-264．

OBSERVATIONS OF FOUR KINDS OF GASTEROPHILUS THIRD INSTARS UNDER SCANNING ELECTRON MICROSCOPY

YANG Hong-xia1, SI Qing2, WU Hui1, YI Chun-yang1, XIE Xiao-wan1, BA Yin-chahan1, GUO Qing-yong1
( 1.Xinjiang Agricultural University, Urumchi 830052, China; 2 .The Veterinary Station of Cahanusun Village Mongolkure Town, Mongulkure 835604, China)

To gather knowledge for the diagnostic characteristics of the third-stage larvae of four equine Gasterophilus species, 200 equine Gasterophilus samples were collected from Ili region, Xinjiang and examined for their morphological identifi cation under stereo microscopy and scanning electron microscopy. The identifi cation basis for Gasterophilus species were their differences of spine rows on every segments, shapes, mouth hooks and stigmal plates. These Gasterophilus samples were found to contain the third-stage larvae of four equine Gasterophilus species, i.e. G.pecorum, G.nasalis, G.haemorrhoidalis and G.intestinalis. Ultramicroscopic observations revealed that the third-stage larvae of G.nasalis` had a “separator like” process on its fi rst thorax area with single spines while double rows of spines were arranged on the fi rst thorax area. Additionally, more differences on the superfi cial stripes of mouth hooks and existence of similar “seta like” structures in superfi cial gullies were noted. The dorsal mandibles of the third-stage larvae of G.pecorum`s expanded andformed the smooth lobes at the apex while the serrate lobes at the apexes were observed in other Gasterophilus species. The differences of morphological characters of G.haemorrhoidalis and G.pecorum were minor but the parasitic positions and characteristics of spine zones were quite different and considered as identifi cation basis. In conclusion, the major identifi cation points of the third-stage larvae of the most common four Gasterophilus were the superfi cial spine rows, mandible lobes of head and superfi cial gully of mouth hooks.

Gasterophilus third-stage larvae; stereo microscope; scanning electron microscope; identifi cation

S852.743

A

1674-6422（2016）05-0051-06

2016-01-11

国家自然基金-新疆联合基金重点项目（U1403283）；国家自然科学基金-新疆联合基金项目（U1503188）；新疆农业大学产学研联合培养研究生项目（xjaucxy-yjs-20151023）

杨红霞，女，硕士研究生，临床兽医学专业

巴音查汗，E-mail：2514062881@qq．com；郭庆勇，E-mail：83949588@qq．com