Hailey-Hailey病四个家系的ATP2C1基因突变分析

梅爱华，李宏文，王婷梅，刘冬先，邓云华

Hailey-Hailey病四个家系的ATP2C1基因突变分析

梅爱华，李宏文，王婷梅，刘冬先，邓云华

目的检测Hailey-Hailey病（HHD）4个家系的致病基因ATP2C1，鉴定其突变位点和突变类型。方法采集4个HHD家系成员共9例患者和6名正常人，与100名无关健康对照者外周静脉血各2 ml，提取全基因组DNA。运用聚合酶链反应（PCR）扩增ATP2C1基因的全部28个外显子及其侧翼内含子序列，扩增产物纯化后进行DNA直接测序，BLAST比对分析其突变位点和突变方式。结果在9例HHD患者中共检出了3个ATP2C1基因致病突变：c.888_889insT（p.296TfsX2）、c.1330delC（p.443QfsX33）和c.2416C＞T（p.Arg806X）。在4个HHD家系的6名正常者和100名健康对照者中均未发现上述突变。结论在9个HHD家系患者中存在2个移码突变（c.888_889insT 和c.1330delC）及1个无义突变（c.2416C＞T），其中2个移码突变为首次报道。这些突变的发现有助于HHD的诊断，并丰富了HHD相关ATP2C1突变数据库。

Hailey-Hailey病；突变分析；ATP2C1基因；DNA测序

梅爱华

Hailey-Hailey病（Hailey-Hailey disease，HHD；OMIM 169600），又称家族性慢性良性天疱疮，是一种常染色体显性遗传性皮肤病[1,2]。其致病基因ATP2C1编码人类高尔基体分泌途径Ca2+/Mn2+-ATP酶蛋白1(hSPCA1)[2,3]。它的突变会导致钙离子依赖的细胞内信号转导通路的异常，从而引起棘层细胞间黏附功能的丧失。HHD临床特征为青少年时期在腋窝和腹股沟等褶皱部位反复发生红斑、水疱、糜烂和浸渍性皮损，常对称分布[1-5]。2013年4月－2015年2月，笔者于皮肤科门诊收集到4个不同HHD家系、共9例HHD患者，在获得遗传学研究的知情同意后，对这4个HHD家系进行了ATP2C1基因突变分析。

1　资料与方法

1.1临床资料

家系1先证者，男，32岁。15岁开始在双侧腹股沟部发生红斑、水疱伴瘙痒，皮损逐渐扩延至双侧腋窝及腰周围（图1a）。3代家系中，母亲和外祖母均有类似疾病。

家系2先证者，男，65岁。18岁开始在双侧腹股沟部出现小片状红斑、糜烂伴痒痛感，后渐发展至双侧腋窝。3代家系中，一子和一孙均有类似疾病，症状均较重（图1b）。

家系3先证者，女， 22岁。19岁开始在双侧股根处部出现小片浸渍红斑伴痒，后在腋窝、乳房下皱褶处出现类似皮损（图1c）。三代家系中，父亲和祖母患有类似疾病。

家系4先证者，男，28岁。17岁开始在双侧股根处发生红斑、斑块、浸渍伴痒痛感，皮损面积逐渐扩大，且在双侧腋窝部出现类似皮损（图1d）。3代家系中，母亲和外祖父患有类似疾病。

4个家系先证者均有典型的临床皮损。皮损组织病理学示：表皮内程度不一的棘层松解，部分呈“坍塌砖墙”样（图1e,1f）。结合病史、临床表现以及皮损组织病理学检查结果诊断为Hailey-Hailey病。

1.2方法

1.2.1外周血DNA提取抽取4个家系中共9例患者和6名正常人与100名无关健康对照者外周血各2 ml，2%EDTA抗凝。采用QIAGEN®全血基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN，德国）提取所有标本的基因组DNA。

1.2.2ATP2C1的DNA序列扩增根据GenBank数据库中基因ATP2C1的DNA序列（NC_000003.12）及PCR引物设计原则，采用软件Primer 5.0 设计特异性引物，共28对。所有引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR 扩增采用Touch-down反应程序进行。部分引物序列如下：P11 F：TGTGAGTATGCACAGCATTCA，R：T G G G C T C C AT G TA ATA G T G AT C T；P16 F：CCAGCCAACCTAGTTACAAG，R C T A A A C C C A A A G G T G G A C A G；P 2 5 F：C A G C TAT T C A C TA G G T G AT T，R：CACTCTACTCAAGTGAGTCA。

1.2.3扩增产物测序及分析纯化后的PCR产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司采用ABI 3730全自动DNA测序仪进行测序。应用Chromas软件进行读图分析，其结果运用BLAST软件与标准ATP2C1序列（NM_001001487）进行比对分析。

图1　Hailey-Hailey病4个家系先证者典型临床及组织病理表现

2　结果

家系1中患者 DNA测序结果显示：在ATP2C1基因的第16号外显子存在第1330位碱基C缺失：c.1330delC（p.443QfsX33）（图2a），该突变可引起mRNA在翻译过程中出现移码，从而导致翻译提前终止形成截短蛋白。家系2患者DNA测序结果显示：在ATP2C1基因的第25号外显子存在第2416位C转换为T而形成无义突变：c.2416C＞T（p.Arg806X）（图2b），该突变可使mRNA第806位编码精氨酸的密码子变为终止密码子，从而使翻译提前终止。家系3患者DNA测序结果显示与家系2患者存在相同的无义突变：c.2416C＞T （p.Arg806X）（图2c）。家系4中的2例患者DNA测序结果显示：在ATP2C1基因的第11号外显子存在第888位碱基与第889位碱基间插入碱基T的移码突变：c.888_889insT （p.296TfsX2）（图2d），该突变可使mRNA翻译过程中出现移码，从而导致蛋白质翻译提前终止。

这些突变均经过了双向测序验证，且在各家系健康成员与100名正常对照者中未发现。

图2　Hailey-Hailey病四个家系患者ATP2C1基因突变点

3　讨论

HHD是一种少见的常染色体显性遗传性皮肤病，以皮肤褶皱部位红斑基础上的松弛性水疱为主要特征，皮损处组织病理学表现为棘层松解，形似“倒塌的砖墙”。流行病学调查发现大约70%患者存在明确的家族史，男女发病率大致相等[1-3]。2000年，Sudbrak等[2]和Hu等[3]通过家系连锁分析和基因定位克隆技术首次发现并报道了HHD的致病基因-ATP2C1，该基因编码一种新型钙离子泵，对维持高尔基体的钙离子浓度起重要作用。迄今为止，国内外学者在不同的HHD家系和散发病例中发现并报道了超过150种HHD相关的ATP2C1基因突变，突变类型包括无义突变、错义突变、剪接位点突变、插入或缺失突变[2-13]。

本研究共收集了4个HHD家系中的9例患者和6名正常人以及100例健康对照者进行ATP2C1基因测序分析，结果发现4个家系中所有患者均存在ATP2C1基因突变。家系1中患者ATP2C1基因的第16号外显子存在碱基缺失突变，家系2和家系3中的患者ATP2C1基因的第25号外显子存在无义突变，家系4中2例患者ATP2C1基因的第11号外显子存在碱基插入突变。家系内的正常人和健康对照者未发现这些突变位点。家系1和家系4患者携带的碱基缺失和插入突变可导致mRNA在翻译过程中出现移码，从而导致终止密码子提前出现，家系2和家系3中患者携带的无义突变可导致mRNA第806位编码精氨酸的密码子变为终止密码子。终止密码子的提前出现可导致蛋白质翻译提前终止，形成截短蛋白，无法发挥正常的功能，维持高尔基体内钙离子浓度，从而导致角质形成细胞间黏附障碍，最终导致表皮棘层松解和疾病的发生。目前，ATP2C1基因突变引起角质形成细胞间黏附异常的机制尚不十分清楚，可能与细胞表面的桥粒蛋白和钙黏素E表达降低有关[14]。

本研究在4个HHD家系中共发现3个ATP2C1基因致病突变，其中2个移码突变（c.888_889insT，c.1330delC）均为首次发现并报道。家系2和家系3中发现的无义突变c.2416C＞T已由Dobson-Stone等[12]于2002年报道，本研究佐证了其研究结果。本研究所发现的ATP2C1基因致病突变，丰富了HHD相关ATP2C1突变数据库，更为患者提供了准确的分子诊断依据。

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（本文编辑祝贺）

Gene ATP2C1 mutation analysis for four Chinese families with Hailey-Hailey disease

MEI Ai-hua，LI Hong-wen，WANG Ting-mei，et al
Department of Dermatology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

Objective To identify ATP2C1 gene mutations in four Chinese families with Hailey-Hailey disease (HHD). Methods Genomic DNA was extracted from peripheral blood of 9 patients and 6 healthy individuals of 4 HHD families and 100 unrelated normal individuals. All 28 coding exons and their flanking sequences of ATP2C1 were amplified by polymerase chain reaction (PCR), then direct DNA sequencing and comparative analysis were performed. Results Three ATP2C1 gene heterozygous mutations, c.888_889insT (p.296TfsX2), c.1330delC (p.443QfsX33) and c.2416C＞T (p.Arg806X), were identified in 9 patients with HHD. The mutations were not found in the healthy members of the 4 families and normal controls. Conclusion Two novel heterozygous mutations of ATP2C1 gene, c.888_889insT (p.296TfsX2) and c.1330delC (p.443QfsX33), were found among these HHD cases in this study. Our findings provided data for molecular diagnosis of these HHD patients, and added new variants to the database of ATP2C1 mutations associated with HHD.

Hailey-Hailey disease；Mutation analysis；ATP2C1 gene；DNA sequencing [J Pract Dermatol, 2016, 6(5):296-299]

R758.5

A

1674-1293(2016)05-0296-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160503

430030武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科（梅爱华，李宏文，王婷梅，刘冬先，邓云华）；湖北医药学院附属东风医院皮肤科（梅爱华）

梅爱华，硕士研究生，研究方向：分子皮肤病学，

E-mail: meiaihua120@sina.com

邓云华，E-mail: yhdeng@tjh.tjmu.edu.cn

（2016-04-02

2016-06-23）