复方消银膏对小鼠银屑病样模型组织病理改变的研究

苏姗姗，姚春丽，李福秋，季永智

· 论著 ·

复方消银膏对小鼠银屑病样模型组织病理改变的研究

苏姗姗，姚春丽，李福秋，季永智

目的研究复方消银膏外用对BALB/c小鼠背部银屑病样模型组织病理的改变。方法①分组：48只小鼠随机分为空白组、模型组、复方消银膏A组、复方消银膏B组、丙酸氯倍他索组及消银膏组。②造模：除空白组外其余各组鼠背部皮肤外用5%咪喹莫特，使其产生银屑病样模型。③治疗及评分：模型组作为对照，复方消银膏A组、复方消银膏B组、丙酸氯倍他索组及消银膏组分别给予相应药物治疗，根据8 d后光镜下各组局部皮肤组织病理变化进行BAKER评分，并进行统计学分析。结果空白组与模型组之间BAKER评分差异有统计学意义（P＜0.05），造模成功；与模型组相比，复方消银膏A组、复方消银膏B组、丙酸氯倍他索组的BAKER评分均降低，且差异均有统计学意义（P＜0.05）；复方消银膏A组、复方消银膏B组与丙酸氯倍他索组相比差异有统计学意义（P＜0.05），而复方消银膏A组与复方消银膏B组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；消银膏组的BAKER评分低于模型组，而高于另外3个治疗组，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论各治疗组均可以改善小鼠银屑病组织病理变化，丙酸氯倍他索组最明显，复方消银膏组次之，消银膏组最差，且复方消银膏A组与复方消银膏B组疗效无明显差异。

银屑病；复方消银膏；动物模型；组织病理

苏姗姗

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，主要表现为红斑、鳞屑，部分患者伴有干燥、瘙痒等不适感。由于其病程长、病因复杂、易于反复、难于根治，银屑病患者身心均承受着巨大的压力。当治疗不当时甚至会演变为红皮病性或关节病性银屑病。外用药直接作用于皮肤表面，不良反应小，可以持久发挥作用。既往外用药以糖皮质激素类药膏为主，但有一定不良反应，而钙调磷酸酶抑制剂价格昂贵，因此我们研制了一种治疗银屑病的新型药膏——复方消银膏。本实验对复方消银膏治疗咪喹莫特刺激产生的银屑病样模型的组织病理学改变进行了研究，为以后临床用药提供初步的数据和资料，结果报告如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药物消银膏由长春中医药大学附属医院提供（吉药制字：Z20130112）。丙酸氯倍他索乳膏（遂成药业股份有限公司研制，国药准字：H20053852）。咪喹莫特软膏购自四川明欣药业有限责任公司（国药准字：H20030128）。

1.1.2动物BALB/c雌性小鼠，6～8 w，体重（20 ±2）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）20140004。

1.2方法

1.2.1实验用药配制复方消银膏A、复方消银膏B由丙酸氯倍他索乳膏和消银膏按1:1、2:1均匀搅拌而成。

1.2.2动物准备所有小鼠适应环境3 d，给药前24 h将小鼠背部脊柱两侧被毛脱毛，面积2 cm×3 cm，注意不可损伤表皮。

1.2.3实验分组及给药48只小鼠，随机分为6组，即空白组，模型组，丙酸氯倍他索组，复方消银膏A组，复方消银膏B组，消银膏组。空白组：每日定时在小鼠裸露背部涂抹适量凡士林。模型组：每日定时在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特62.5 mg。丙酸氯倍他索组、复方消银膏A组、复方消银膏B组、消银膏组均定时在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特62.5 mg，同时分别给予等量丙酸氯倍他索、复方消银膏A、复方消银膏B、消银膏外用。8 d后处死小鼠并剪取小鼠背部皮损组织，置于10%甲醛中固定。

1.2.4实验疗效评估依次经过脱水、透明、浸蜡、包埋后制成蜡块，切厚度3 μm切片进行HE染色，显微镜下观察组织病理改变，进行BAKER评分[1]。

BAKER评分具体标准如下：表皮层中发现Munro小脓肿2.0分；角化过度0.5分；角化不全1.0分；颗粒层变薄或消失1.0分；棘层增厚1.0分；皮突延长、起伏根据轻中重度分别计0.5分、1.0分、1.5分。真皮层中单一核或多核细胞浸润根据轻中重度分别计0.5分、1.0分、1.5分；乳突上顶0.5分；毛细血管扩张0.5分。

1.3统计学分析

应用SPSS22.0软件对实验数据进行统计学分析，计量资料均采用均数±标准差（ x¯ ±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义的检验标准。

2　结果

2.1模型构建及各组组织病理改变

空白组镜下可见皮肤结构完整，细胞形态正常，未见明显异常改变（图1）。

模型组银屑病样皮损见图2a。皮损组织病理可见Munro小脓肿，表皮明显的角化过度及角化不全，棘层重度肥厚，伴有明显的毛细血管扩张，重度炎性细胞浸润（图2b，2c）。

图1　空白组小鼠组正常皮肤组织病理

图2　模型组小鼠造模后临床皮损及组织病理（HE染色×100）

图3　丙酸氯倍他索组小鼠皮损组织病理（HE染色×100）

图4　复方消银膏A组与复方消银膏B组小鼠皮损组织病理（HE染色×100）

图5　消银膏组小鼠皮损组织病理（HE染色×100）

丙酸氯倍他索组（图3a，3b）、复方消银膏A组（图4a）、复方消银膏B组（图4b）镜下均未见Munro小脓肿，表皮角化过度及角化不全现象减轻，棘层变薄，炎性细胞浸润现象明显减少。其中丙酸氯倍他索组部分皮损可见新生毛囊。

消银膏组未见Munro小脓肿，但可见明显的角化过度及角化不全，棘层中重度肥厚，毛细血管扩张，重度炎性细胞浸润（图5）。

2.2各组小鼠BAKER评分

通过F检验（F=72.972，P＜0.05）判断各组小鼠之间的BAKER评分有显著差异，进一步两两比较采用LSD探索性分析。方差分析表明空白组与模型组之间差异有统计学意义（P＜0.05），提示小鼠背部产生银屑病样组织病理改变，造模成功。各治疗组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示各组均有治疗作用。复方消银膏A组、复方消银膏B组与丙酸氯倍他索组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。复方消银膏A组、复方消银膏B组与消银膏组相比差异有统计学意义（P＜0.05），而复方消银膏A与复方消银膏B组之间差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1　各组小鼠BAKER评分（分）

3　讨论

银屑病是一种常见的免疫介导的慢性炎症性皮肤病，其典型的组织病理变化为表皮角化不全、角化过度、上皮突向下延长、颗粒层变薄或消失、棘层增生肥厚，真皮可见新生血管的扩张迂曲，并伴有大量单一核或多核细胞的浸润。

一个理想的银屑病样动物模型必需能模拟银屑病的组织病理学特征且有一个与银屑病相似的发病机制，同时能够对银屑病药物有治疗反应[2]。但是银屑病病因复杂，目前还没有能够模拟出全部的银屑病样表现及其相关的炎症情况的动物模型。

咪喹莫特作为新型的局部免疫调节剂，属于Toll样受体激动剂，用于人类乳头瘤病毒引起的生殖器和肛周疣[3]、光化性角化病等的治疗。临床应用中发现患者在外用咪喹莫特乳膏时银屑病会加重或复发[4]。实验研究发现咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮损主要依赖于白细胞介素（IL）-23/IL-17炎性反应轴[5]，此外还有IL-27激活辅助性T淋巴细胞（Th）1细胞应答途径及氧化应激途径。咪喹莫特诱导产生的小鼠皮损具有典型的银屑病表型和组织学特点，与人类银屑病有很多相似之处，且操作简单、经济、重复性高，是研究银屑病的理想动物模型。因此本实验选用咪喹莫特刺激BALB/c小鼠产生银屑病样模型。

鉴于银屑病的高复发率和口服药物的系统性不良反应，对于病情极轻、发展极慢的静止期患者可单纯采用外用药治疗。外用药的恰当使用可以有效地控制病情、迅速改善症状，而外用药与系统用药、物理疗法的联合应用，则可以提高疗效，减轻不良反应的发生。因此，正确选择外用药显得尤为重要。银屑病理想的外用药应在针对病因机制治疗的同时不良反应小，能大面积涂擦。

复方消银膏是消银膏和丙酸氯倍他索按一定比例混合而成，它使中西医有机的结合在一起，既解决了中药起效慢、疗程长的问题，又减少了糖皮质激素制剂的用量，短期内达到较好疗效，使患者能坚持和配合较长疗程的治疗。消银膏是长春中医药大学附属医院研发的外用中药膏，组方为黄连、黄芩、当归、生地、姜黄，主要用于治疗炎症性皮肤病及银屑病。丙酸氯倍他索是治疗银屑病常用的糖皮质激素类药物，具有抗炎和抑制细胞增生的作用。

黄青等[6]研究报道黄连可以通过抑制人角质形成细胞的增生发挥治疗银屑病的作用，并且具有明显的量效关系。同时黄连还具有免疫抑制和免疫调节作用。

向延卫等[7]研究表明芩珠凉血方（黄芩为君药）可以调节患者血清中IL-17、IL-23的水平，以及调控患者皮损信号转导及活化因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）和转录因子孤核受体（RORγt）的表达，起到对血热证银屑病患者的治疗作用。吴珺等[8]的研究表明，黄芩的主要成分均可抑制T淋巴细胞活化的作用，从而抑制银屑病的发生及发展。

杨钦红[9]研究表明，当归多糖通过活化巨噬细胞和T淋巴细胞并通过IL-2 和 干扰素（IFN）-γ的诱生发挥其免疫调节作用。景海霞等[10]研究表明，当归多糖的免疫调节作用可能存在双向性，使紊乱的免疫状态趋于平衡，从而治疗银屑病等免疫异常性疾病。

生地能扩张血管，减低毛细血管的通透性，抑制血管内皮炎症，与改善银屑病组织病理中大量毛细血管的炎性增生有关[11]。韩振翔等[12]用大鼠实验研究发现，大剂量生地预处理可明显降低治疗后血清中肿瘤坏死因子（TNF）-α 的水平，而TNF-α是目前被认可的与银屑病发生及预后有密切关系的细胞因子。

姜黄素能抑制被诱导高表达的环氧酶2，脂氧合酶，诱导型一氧化氮合酶，抑制细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）的产生、抑制转录因子（如核转录因子NF-κB，抗磷脂抗体APl）的激活。姜黄素同时具有免疫调节的作用，能调节T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和树状突细胞的活性，还能调节多种炎性细胞因子的表达及其介导的作用（如IL-1、IL-2、IL-6等），这些与银屑病的发病密切相关[13]。

5%咪喹莫特外用后模型组的BAKER评分为（7.38 ±1.06）分，经复方消银膏A、复方消银膏B、丙酸氯倍他索及消银膏治疗后的BAKER评分分别下降为（3.31±0.53）分、（4.88±1.03）分、（4.31±0.88）分及（5.93 ±0.90）分，结合各组的组织病理表现及BAKER评分可以明显看出，各治疗组都可以改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样组织病理变化（P＜0.05），但丙酸氯倍他索组最明显，复方消银膏组次之，消银膏组最差。消银膏组疗效差，考虑可能与消银膏完全由中药成分组成，起效缓慢且治疗时间较短有关。银屑病一般治疗时间长，部分患者皮损面积大，考虑糖皮质激素的不良反应，因此可以选用复方消银膏治疗银屑病。复方消银膏A、复方消银膏B在治疗银屑病方面疗效确切且二者之间差异无统计学意义（P＞0.05），两组复方消银膏治疗银屑病时疗效相当，复方消银膏B中消银膏与糖皮质激素比例为1:2，而复方消银膏A中消银膏与糖皮质激素比例为1:1，因此建议选用糖皮质激素浓度低的复方消银膏A在临床上进一步推广，以减少不良反应的发生。本实验对咪喹莫特刺激产生的银屑病样模型做了组织病理方面的研究，为今后临床用药提供良好了的实验依据。

[1] Baker BS, Brent L, Valdimarsson H, et al. Is epidermal cell proliferation in psoriatic skin grafts on nude mice driven by T-cell derived cytokines [J]. Br J Dermatol, 1992, 126(2):105-110.

[2] Van der Fits L, Mourits S, Voerman JS, et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/ IL-17 axis [J]. J Immunol, 2009, 182(9):5836-5845.

[3] 丁小洁, 熊心猜, 王亚琴. 咪喹莫特对尖锐湿疣皮损朗格汉斯细胞的影响 [J]. 实用皮肤病学杂志, 2014, 7(3):182-184.

[4] Rajan N, Langtry JA. Generalized exacerbation of psoriasis associated with imiquimod cream treatment of superficial basal cell carcinomas [J]. Clin Exp Dermatol, 2006, 31(1):140-141.

[5] Bettelli E, Korn T, Oukkal M, et al. Induction and effector functions of Th17 cell [J]. Nature, 2008, 453(7198):1051-1057.

[6] 黄青, 瞿幸, 吴清, 等. 黄连、土大黄、苍术提取液抗银屑病实验研究[J].中国中医药信息杂志, 2008, 15(6):30-31.

[7] 向延卫, 范斌, 徐荣, 等. 芩珠凉血方对银屑病血热证患者血清IL-17、IL-23及皮损中相关转录因子的影响 [J]. 南京中医药大学学报, 2016, 32(4):326-329.

[8] 吴珺, 刘欣, 邱泽计, 等. 黄芩主要成分对PDB+Ion诱导的Jurkat T细胞CD69表达的影响 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(9):188-189.

[9] 杨钦红. 当归多糖组分促进淋巴细胞增殖及对IL-2和 INF-γ的诱生作用 [J]. 中药材, 2005, 28(5):405．

[10] 景海霞, 周辉, 段德鉴, 等. 当归多糖对银屑病患者外周血单一核细胞NF-κB及IFN-γ的影响 [J]. 中国麻风皮肤病杂志, 2013, 29(12):769-772.

[11] 王朴. 生地黄的现代药理研究与临床应用 [J]. 中国中医药现代远程教育, 2008, 6(8):86.

[12] 韩振翔, 魏江磊, 祁丽丽, 等. 生地预处理对全脑缺血再灌注大鼠血清 TNF 与 NSE 表达的影响 [J]. 中国康复医学杂志, 2009, 24(3):248-249.

[13] 彭立新. 几种化合物对THP-1细胞TLR-4信号传导通路相关因子的影响 [D]. 北京:中国协和医科大学, 2010.

（本文编辑耿建丽）

Pathologic observation about the influence of compound xiaoyin-ointment on psoriasis-like mice model

SU Shan-shan，YAO Chun-li，LI Fu-qiu，et al
Department of Dermatology, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130000, China

Objective To observe the pathological changes of the psoriasis-like BALB/c mice model treated by compound xiaoyinointment. Methods Forty-eight mice were randomly divided into six groups: blank group, model group, compound xiaoyin-ointment treatment group A, compound xiaoyin-ointment treatment group B, clobetasol propionate treatment group, xiaoyin-ointment treatment group. 5% imiquimod was applied on the back of all mice except blank group to produce psoriasis-like mice model. All the groups except blank group and model group were treated with corresponding ointment for 8 days. Then pathological manifestations (BAKER score) were investigated under light microscope and statistical analysis were performed. Results The difference of BAKER score between blank group and model group showed statistical significance(P＜0.05), which indicated successful psoriasis-like mice model. Compared with model group, the BAKER scores of compound xiaoyin-ointment treatment group A, compound xiaoyin-ointment treatment group B and clobetasol propionate treatment group were lower with statistical significance(P＞0.05). The difference of BAKER scores between clobetasol propionate treatment group and compound xiaoyin-ointment treatment group showed statistical significance(P＜0.05), but the differences between compound xiaoyin-ointment treatment group A and compound xiaoyin-ointment treatment group B showed no statistical significance(P＞0.05). The BAKER score of xiaoyin-ointment treatment group was lower than model group and higher than other three treatment groups with statistical significance(P＜0.05). Conclusion Psoriasis pathologic changes caused by imiquimod were remarkably improved after being treated with these four kind of ointments. For the efficacy, the clobetasol propionate treatment group was the most obvious, the second was the compound xiaoyin-ointment treatment group, and the xiaoyin-ointment treatment group was the worst. However there were no significant differences between compound xiaoyin-ointment treatment group A and compound xiaoyin-ointment treatment group B.

Psoriasis；Compound xiaoyin-pintment；Animal models；Pathologic[J Pract Dermatol, 2016, 6(5):289-292]

R758.63

A

1674-1293(2016)05-0289-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160501

吉林省科技发展计划项目（20130727016YY）

130000 长春，吉林大学第二医院皮肤科（苏姗姗，姚春丽，李福秋，季永智）

苏姗姗，硕士研究生，E-mail：sushan1007@163.com

李福秋，E-mail: lifuqiu@medmail.com.cn

（2016-04-17

2016-05-09）