不同的病原菌检测方法比较评价可疑布鲁氏菌

多里坤·努尔沙发，阿曼古力·马木提，米吉提·莫合他尔汗

（新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐 830011）

实验研究

不同的病原菌检测方法比较评价可疑布鲁氏菌

多里坤·努尔沙发，阿曼古力·马木提，米吉提·莫合他尔汗*

（新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐 830011）

目的：寻找布鲁氏菌病病原学检测工作的一种便利、快速、特异及敏感性较高的快速诊断方法。方法：收集247份病料，并经细菌学方法分离方法得到26株可疑家畜布鲁氏菌株，接着用分子生物学VirB8-PCR和AMOS-PCR方法对这批可疑菌株进行确诊鉴定，并对不同对比试验方法结果及应用价值进行了评价。结果：细菌学分离方法与VirB-PCR及AMOS-PCR方法结果一致。AMOS-PCR方法结果同时还显示26株可疑家畜布鲁氏菌株包括19株菌为羊种布鲁氏菌和7株菌为牛种布鲁氏菌。结论：细菌学分离方法所需时间较长、繁琐有感染风险，且不能确定被检可疑布鲁氏菌的属性；VirB-PCR方法虽然快速、敏感、比较安全等，但是只能确定布鲁氏菌，而不能鉴别菌株属性；AMOS-PCR方法快捷、经济、安全、便利、特异，敏感，且能鉴别菌株属性。

家畜布鲁氏菌株；细菌学分离；VirB8-PCR；AMOS-PCR；检测方法比较

布鲁氏菌病原学快速鉴别诊断方法的成功应用，在布病防制工作中的早发现疫情，及时追踪溯源，减少损失、成功实施防疫措施的关键性保障技术。对一些细菌分离培养得到非典型布鲁氏病菌株和变异可疑菌株，不能用传统方法快速、安全、特异、敏感的进行鉴别诊断，但是PCR方法在布病检测领域的成功利用，一定程度上满足了上述传统方法不能达到的检测所求。据笔者了解，对布病不同的PCR检测方法研究报道的较多见，但是在日常病原学检测中应用这些方法、并对这些方法应用价值进行比较、评价的报道少见。为了寻找适合布病病原学检测，并具备快速、特异、敏感、便利等特点诊断方法，本课题组采用了上述特点具备的VirB8-PCR及AMOS-PCR方法、对细菌学分离得到可疑布鲁氏菌株进行检测确定种属，同时对上述三种检测方法的应用价值进行评估，确定优先方法，便于日后检测工作顺利进行。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 在南北疆设2个采样点共收集病原学组织（牛、羊流产胎儿）病料247份，其中羊流产胎儿187份，牛流产胎儿60份。

1.1.3 仪器耗材生物培养箱；玻璃干燥缸；PCR仪；电泳仪；图像分析仪；一次性培养皿；蜡烛；移液枪头；微量加样器等。

1.2 方法

1.2.1 布鲁氏菌细菌学分离方法根据布鲁氏菌病实验室研究技术进行，不进行生化试验。

1.2.2 VirB8-PCR和AMOS-PCR方法分别根据其说明书进行，并且不同方法检测结果进行对比评价。

2 结果

2.1 可疑菌株的分离

共分离的26株可疑菌，其中从60份牛流产胎儿经厌氧培养分离得7株菌，需氧培养未能分离到可疑菌株，从187份羊病料经需氧培养检出19株菌，该两株菌的生长特性符合牛种和羊种布鲁氏菌的生长特点。

2.2 两种PCR方法检测结果及与细菌分离方法的对比评价

26株可疑菌经VirB8-PCR检测、均为布鲁氏菌，该方法只能鉴别属，不能鉴别种。而经AMOS-PCR方法鉴定，牛胎儿分离7株菌，均为牛种布鲁氏菌，羊胎儿分离19株菌，均为羊种布鲁氏菌。三种试验对比结果分析详见表1。

表1 三种试验对比结果分析

3 讨论

3.1 经细菌学分离方法分离得到26株可疑菌株。此方法的分离过程较长，需要5～20d，试验前后所需准备和消毒处理的器材较多、培养基的营养条件要求较高，对操作条件及操作人员要求苛刻，有一定的感染风险,该方法分离得到菌株的最终确诊还的借助其它检测方法来实现。分离株在胰蛋白示固体培养基上呈无色、透明、圆形、光滑，以肉眼容易辨别的菌落，菌种的培养、生长特性，显微镜下菌体形态均符合布鲁氏菌的初步判定标准，为下一步试验提供了有一定参考价值的科学依据，尤其是该方法与AMOS-PCR方法的结合鉴定，使AMOS-PCR检测结果有了可比性参照对象，对AMOS-PCR方法的准确率和可信度等主要标准的科学评价有了试验依据。

3.2 VirB-PCR方法与细菌分离方法对布鲁氏菌属的鉴定符合率为100%、检测结果均为布鲁氏菌。这与张付贤等所指出的结果完全吻合。该方法不但能在1d之内可捡出鉴定结果，而且有操作简便、相对安全、成本较低、敏感，便利等特点，但是该方法只能鉴别布鲁氏菌的属，而不能鉴定种。

3.3 AMOS-PCR方法与细菌分离方法方对布鲁氏菌属的鉴定符合率完全一致。该方法能鉴别不同菌种，而且检查结果与传统方法符合率较高等相关研究基本一致。该方法基本性能与VirB-PCR相同，但该方法能够鉴定菌种，在确诊疫情、追踪溯源、实施防控措施等工作中，可以作为布病病原学检测方法中优先考虑方法之一。

3.4 PCR方法虽然具备上述比较优越性能、但是该方法需PCR仪、图像分析仪等仪器，没有一个统一的检测标准，PCR的准确性作出评估等原因，因此在一定程度上影响其应用。

综上所述，布鲁氏菌诊断所用以上细菌学分离方法、VirB-PCR方法及AMOS-PCR方法等方法中，AMOS-PCR方法值得推广。还应该需要说明此次检测的菌株数量较少,只牵扯引起牛羊发病的部分菌株，家畜和菌株种类都较少，可比范围有一定的局限性，不能说所有布鲁氏菌种都特异，鉴别诊断确诊率高，而且对家畜布病流行情况的分析及PCR方法准确性作出评估都有具有一定的局限性。需在今后的工作中不断摸索完善。

［1］李长友，等.动物布鲁氏菌病防治指导手册［M］.中国农业出版社出版2012，第一版，第二章，第一节.

［2］李坚，等.用PCR法对布鲁氏菌进行筛查及分型鉴定的研究［J］.中国地方病防治杂志，2009，24（4）:302.

［3］布鲁氏菌病实验室研究技术［M］.1983,第一章，第一节.

［4］张付贤，等.布鲁菌鉴别诊断方法的研究进展［J］.中国生物制品学杂志.2008，21（11）:1026.

［5］姜海，等.AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定的应用［J］.中国人兽共患病学报.2009，25（2）:109.

［6］毛景东，等.布鲁氏菌病的研究进展［J］.中国畜牧兽医. 2011，38（1）:225.

［7］人畜共患病培训教材.第二章,第五节.农业部兽医局中国动物疫病预防控制中心编.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．01.005

新疆少数民族科技人才特殊培养计划科研基金项目（No：201123109）

★通讯作者：米吉提·莫合他尔汗（1972～），哈萨克族，高级兽医师，研究方向：布病防制

多里坤·努尔沙发（1969～），哈萨克族，本科，高级兽医师，主要从事家畜布病防制工作