牛膝多糖体外对猪外周血淋巴细胞增殖的研究

陈春

（广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021）

牛膝多糖体外对猪外周血淋巴细胞增殖的研究

陈春

（广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021）

本试验研究牛膝多糖（ABP）体外对猪外周血淋巴细胞增殖的影响。在培养体系中分别添加不同浓度的ABP（0，100，200，300，400，500ug/mL），采用四唑盐（MTT）法测定外周血淋巴细胞的增殖。研究结果表明：不同浓度的ABP均能直接显著促进猪外周血淋巴细胞的增殖（P＜0.05），且其作用有一定的剂量依赖关系。

牛膝多糖；外周血淋巴细胞；猪

牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharide，ABP）是从牛膝根(Achyranthes bidentata B1)中提取、分离、纯化得到的一种小分子水溶性的多糖化合物。近年来国际国内对ABP进行大量的研究，结果表明，ABP是一种免疫调节剂,具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒和多种免疫调节作用。但是有关ABP对仔猪外周血淋巴细胞增殖的影响报道较少，外周血淋巴细胞增殖是反应动物细胞免疫的一个重要指标，测定淋巴细胞增殖效果是研究机体细胞免疫功能的重要手段之一。通过ABP直接对猪外周血淋巴细胞增殖的影响，为进一步开展ABP提高仔猪免疫功能的机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及材料胎牛血清；淋巴细胞分离液；RPMI-1640培养基；细胞培养板，细胞计数板，0.22μm微孔滤膜抽滤器；其它试剂均为分析纯；牛膝多糖（含多糖97%）。

1.1.2 主要试剂的配制D－Hank’s平衡盐：分别称取8.00g NaCl、0.40g KCl、0.06g KH2PO4、0.35gNaHCO3、0.08g Na2HPO4·H2O、1.00g葡萄糖，加入三蒸水1000mL溶解，调pH至7.2～7.4，8磅15 min高压蒸汽消毒灭菌，冷却后无菌条件下分装，4℃冰箱内保存备用高压消毒，放于4℃冰箱中保存备用逐个溶解于800mL蒸馏水中。

肝素抗凝剂：称取7.15mg肝素钠粉末，溶于10mL生理盐水中，抽滤即得10 000U/mL母液。

抗菌素液（双抗）：称取青霉素钠62.5mg（160IU/mg），硫酸链霉素钠100mg，溶于10mL灭菌的Hank’s液中，抽滤，得到含青霉素、链霉素分别为10000IU/mL和10000μg/mL的双抗母液。

4%的台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100mL，用滤纸过滤，4℃保存。使用时用PBS稀释至0.4%。

RPMI-1640完全培养基：87%RPMI-1640+1%双抗母液＋10%胎牛血清，用5.6%的无菌NaHCO3调其pH至7.2～7.4。

四唑盐（MTT）溶液（5mg/mL）：50mg MTT，用10mL三蒸水溶解，抽滤；PHA母液（500μg/mL）：5mgPHA，用10mL RPMI-1640溶解，抽滤，分装备用；甲瓒裂解液：于200mL体积分数为50%二甲基甲酰胺（DMF）溶液中缓慢加入十二烷基硫酸钠（SDS）28g，磁力搅拌器充分溶解后，普通滤纸过滤，用pH调节混合液调pH至4.7。

1.1.3 主要仪器酶联免疫检测仪，倒置显微镜, 5%CO2培养箱，立式自动电热压力蒸汽灭菌器，电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 试验设计随机选取一头体重约10kg的健康杜×长×大，前腔静脉采血，分离淋巴细胞，然后按以下设计进行体外培养。实验组（100μg/mLABP，200μg/mLABP，300μg/mLABP，400μg/mLABP，500 μg/mLABP，空白组设6个组，每个处理设7个重复。

1.2.2 采用MTT法测定外周血淋巴细胞增殖

1.2.2.1 分离外周血淋巴细胞取肝素抗凝血（含肝素20U/mL）10mL，与等量的D-Hank’s液混匀，按1:1缓慢加于淋巴细胞分离液上，25℃2500r/min离心20min，吸取中间白细胞层，然后按1mL血加5 mL红细胞裂解液，静置5min，1500r/min离心10 min，弃上清，再用D-Hank’s洗涤2次，弃上清，用RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）洗涤1次，离心，弃上清，最后用RPMI-1640完全培养基吹打成悬液。

1.2.2.2 淋巴细胞成活率测定及细胞计数

（1）计数板：用无水酒精或95%酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。把盖玻片覆盖在计数板上，使之微微移向一侧，露出计数板面少许，以滴加细胞悬液。

（2）染色：取吸管1支，深入淋巴细胞悬液中，轻轻反复吹打淋巴细胞悬液，使淋巴细胞重悬均匀后，立即吸取淋巴细胞悬液少许，向另一干净离心管内滴入细胞悬液9滴，再滴入0.4%台盼蓝染液1滴，混匀，放置2～3min。

（3）加悬液：把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴入1～2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间隙。

（4）计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方，不计右侧和下方。

（5）计算：原细胞悬液的细胞浓度（个/mL）=

（6）镜下观察细胞对台盼蓝染液的排斥情况：细胞胞体透亮的，表明其活力良好；细胞胞体蓝染的，则视为死亡。在镜下数200个细胞，计算活力良好的百分比，细胞活力大于95%者用于细胞培养。

1.2.2.3 淋巴细胞的接种培养及MTT法测定通过计数得知悬液中淋巴细胞数后，用完全培养基调整细胞数为2×106/mL，除空白组外，每孔加入淋巴细胞悬液50μL，然后按试验设计每孔分别加入含不同浓度ABP，即每孔最终体积为100μL，最终细胞浓度为1×106个/mL，空白调零其它每孔加入100μL RPMI-1640完全培养基。置于37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱内静置培养44h。每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续孵育4h，然后每孔加入100μL 14%SDS-50%DMF溶液，继续孵育2h，选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，即OD570。

1.3 数据处理与分析

采用SAS（V8）统计软件进行了单因子方差分析，经单因子方差分析差异性显著的再利用LSD法进行多重比较，所有数据均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

表1 ABP对猪外周血淋巴细胞增殖的影响

通过MTT试验测出外周血淋细胞在5种不同浓度牛膝多糖中的吸光度值如表1，各浓度组与对照组比较,可以看出细胞中添加牛膝多糖均不同程度的促进外周血淋细胞的增值（P＜0.0001）。5个牛膝多糖组除了200μg/mLABP组外，基本上是随着ABP的增加，外周血淋巴细胞增殖加强。

3 讨论

淋巴细胞增殖是机体细胞免疫水平的一个重要评判指标，大量的研究表明ABP能促进淋巴细胞的增殖，李宗楷等研究发现ABP能提高老年鼠T淋巴细胞的增殖。陈清华等研究ABP添加在饲粮中，可以显著提高仔猪外周血淋巴细胞转化率。季敬璋等发现ABP能诱导人T细胞分泌γ干扰素（IFN-γ），并有一定的量效和时效关系。邱妍等研究报道ABP能促进雏鸡外周血T淋巴细胞的增殖。本试验结果表明，5个试验组有4个组随着ABP量的增加（P＜0.05），外周淋巴细胞的增殖逐渐加大。但除第2组例外，没有显著变化，需进一步研究。表明ABP能促进猪外周血淋巴细胞的增殖，提高免疫力作用。并存一定的剂量关系。

4 结论

本试验结果表明，牛膝多糖对外周血淋细胞增殖具有明显的促进作用，且呈非典型的剂量依赖关系；最佳的剂量关系需待进一步的研究。

［1］中华人民共和国药典委员会编.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2000：54.

［2］张云峰，等.牛膝多糖的生物学功能研究进展［J］.牧兽医杂志，2007，6（4）:27－29.

［3］陈洪亮.植物多糖的制备及对肉仔鸡免疫功能影响的研究［D］.北京:中国农业科学院，2002.

［4］金海丽，等.多糖抗病毒及免疫调节作用研究进展［J］.中国饲料，2002，（9）:5-7.

［5］卢杏通，等.多糖类免疫调节剂研究概况［J］.动物医学进展，2003，24（1）:10-12.

［6］李宗楷，等.牛膝多糖的免疫调节作用［J］.药学学报，1997，32（12）:881-887.

［7］陈清华.牛膝多糖对猪的营养效应和免疫调空机理研究［D］.博士学位论文，湖南农业大学，长沙.2008，83-89.

［8］季敬璋，等.牛膝多糖体外诱导人T细胞表达IFN-γ和IL-4的机制探讨闭［J］.中国免疫学杂志，2003，19（9）:611-613.

［9］邱妍，等.4种多糖对免疫雏鸡抗体效价和T淋巴细胞的影响［J］.南京农业大学学报，2008，31（1）:77-81.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．01.006

陈春（1985～），广西人，主要从事实验动物管理