低能氮离子注入三孢布拉氏霉诱变育种方法研究∗

陈恒雷，吕长武

(新疆大学物理科学与技术学院，低能离子注入与生物工程实验室，新疆乌鲁木齐830046)

0 引言

β-胡萝卜素是国家允许使用的食品添加剂，具有着色和营养作用．FAO和WHO食品添加剂委员会一致推荐并认定β-胡萝卜素是A类营养色素．大量研究证实：β-胡萝卜素的许多生物功能与人类健康有密切关系，其生理活性已被越来越多地证实并应用于疾病的预防和治疗；β-胡萝卜素除了用于维生素A缺乏和光敏患者的治疗，还可用于皮肤病、抗光敏症、支气管炎和慢性咽炎等疾病．另外，国内外大量实验证明β-胡萝卜素能防治或延缓癌症，是癌症的对抗剂．不仅如此，它也是一种难得的具有广泛免疫功能的药物和不可缺少的饲料添加剂．随着对β-胡萝卜素认识的深入，对其应用将更加广泛[1]．

β-胡萝卜素的生产方法有化学合成法、植物提取法和微生物发酵法三种．目前利用三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素具有非常好的前景，而且可以实现工业化生产[2]．离子束诱变育种是我国科学家于上世纪八十年代中期开创的一种生物品种改良技术，该技术已成功地应用于小麦、玉米、番茄、甜菜等多种农作物的品种改良和高产抗生素、酶制剂、氨基酸等微生物的诱变育种中，由于离子注入具有能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷的中和与交换联合作用等多重效应，其诱变效果更加明显[3−5]．本研究基于离子束显著的诱变功效，采用不同能量剂量组合的低能氮离子注入三孢布拉氏霉负菌孢子，考察低能氮离子注入对三孢布拉氏霉的生物学效应，积极探索筛选β-胡萝卜素高产菌株的诱变育种方法，以期为三孢布拉氏霉菌工业化生产中持续的菌种改良提供方法学参考．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）CCTCC(＋)(－)菌，购自武汉大学生命科学院．

1.1.2 仪器

LCD-1000型多功能离子注入机，西南核物理研究所；LRH-150B生化培养箱，广东省医疗器械厂；ZHWY-2102新型恒温震荡器，乌鲁木齐祥生仪器有限公司；L-3000高效液相色谱仪，北京普源精电科技有限公司；METTLER-TOLEDO精密分析天平(万分之一)，METTLER TOLEDO Group．

1.1.3 培养基

⑴固体培养基的成分为（w/v）：玉米粉4.7%、麦芽浸粉1.0%、琼脂粉0.8%，50◦C温水调制定容，pH值灭菌前以6.4为宜；

⑵种液培养基的成分为（w/v）：玉米粉4.7%、黄豆粉2.3%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁500ppm、氯化钙50ppm、硫酸亚铁50ppm、硫酸锰50ppm、硫酸铜50ppm、VB14ppm，冷水调制定容，pH值灭菌前以6.4为宜；

⑶发酵培养基的成分为（w/v）：玉米油10%、玉米粉1.925%、黄豆粉4.4%、1.0%正十二烷、磷酸二氢钾0.055%、磷酸氢二钠0.336%、磷酸二氢钠0.018%、VB10.4ppm，冷水调制定容，pH值灭菌前以7.5为宜．

1.2 实验方法

1.2.1 单孢子悬液的制备

用无菌接种环辅助10mL无菌水洗脱经过平板恒温培养、温度刺激产孢量最大化的三孢布拉氏霉负菌孢子，取0.2mL单孢子悬液用血细胞计数板进行计数，确定合适的稀释倍数后，用移液枪吸取0.2mL单孢子悬液涂至无菌空白培养皿，置于超净工作台，风干制备菌膜．

1.2.2 低能氮离子注入诱变

将风干制备的三孢布拉氏霉负菌孢子菌膜置于LCD-1000型多功能离子注入机的小真空室，分别采用能量15 keV、剂量(0、4、6、8、10、12、14)×1015cm−2的N+束，在压强为2.5×10−3Pa的真空状态下，以5s/次、间隔15s的脉冲方式注入．

1.2.3 筛选方法

1.2.3.1 平板培养定性初筛

分别用2ml无菌水将不同能量剂量组合注入后的三孢布拉氏霉负菌孢子洗脱转接到6个固体培养基上28◦C恒温培养，纪录新生菌落的长势和产孢量，将菌丝长势与真空对照菌株差异显著的菌落转接到斜面固体培养基上28◦C恒温培养，以备复筛之用．

1.2.3.2 摇瓶发酵定量复筛

分别将经过28◦C 6h的正、负菌斜面置于18◦C8h，然后用无菌接种环辅助10mL已灭菌的生理盐水洗脱孢子囊，按10%接种量移种于装有50mL种液的500mL无菌三角瓶中，28◦C恒温培养48h．将经过培养的正负菌按1:10的比例[6]接种于装有50mL发酵培养基的500mL无菌三角瓶中，28◦C恒温发酵96h．发酵结束后经离心收集菌体并测定生物量和β-胡萝卜素含量，根据单位体积内β-胡萝卜素产量确定高产菌株．

1.2.4 分析方法

1.2.4.1β-胡萝卜素含量测定

用高效液相色谱测定发酵液中的β-胡萝卜素[7]．流动相为甲醇：四氢呋喃：水=70:26:4，检测波长为472nm，进样量30 mL，流速为1.5 mL/min，β-胡萝卜素的出峰时间为17-18min．

1.2.4.2 菌丝体生物量测定

将发酵液转入离心管中，以5000 r／min离心10 min，弃去上清液，沉淀水洗后再次离心，所得菌体于45◦C.

1.2.4.3 存活率计算

以真空下未经离子束辐照菌株为对照，记录真空、各剂量处理后平板培养新生菌落数，存活率＝各剂量下存活菌落数/真空下存活菌落数×100%．

1.2.4.4 突变率计算

以真空下未经离子束辐照菌株为对照，考察摇瓶发酵定量复筛单位体积发酵液中β-胡萝卜素的产量．其中产量比出发菌株小于5%的视为负突变株，大于5%的视为正突变株，在5%以内的视为无义突异株．正、负突变率分别等于正、负突变株占全部被考察菌株的比率．

2 结果与分析

2.1 不同剂量氮离子注入对三孢布拉氏霉存活率的影响

通过低能氮离子注入对三孢布拉氏霉存活率的影响试验结果发现：随着N+注入剂量的增加，三孢布拉氏霉的存活率呈现先减小后增大再减小的“马鞍型”剂量-效应曲线（见图1）．出现这种现象的原因是低剂量时离子束只对孢子细胞表面进行损伤和刻蚀，因而存活率较高；随着注入剂量的增加，细胞表面刻蚀严重，离子损及细胞内部并产生大量自由基和软射线等，使存活率急剧下降，但下降到一定值时，DNA修复和复制相关基因发生了碱基替换和插入删除突变，参与切除修复途径基因的转录水平也有不同程度的提高，使得存活率有所回升，突变率有所增大；当剂量增加到一定时，细胞损伤已无法修复，存活率再次迅速下降，这在王姗杰等[8]低能氮离子注入诱变选育高产结冷胶菌株的研究中也呈现相似的“马鞍型”剂量-存活率曲线．

图1 不同剂量氮离子注入对三孢布拉氏霉存活率的影响

2.2 不同剂量氮离子注入对三孢布拉氏霉菌丝长势的影响

通过离子注入对三孢布拉氏霉突变率影响的计算结果（见图2）发现，采用能量l5keV、剂量4×1015N+/cm2～14×1015N+/cm2对三孢布拉氏霉菌株进行诱变筛选，随着注入剂量的增大，三孢布拉氏霉的总突变率和正突变率呈现先增加后减小的变化趋势，以12×1015N+/cm2为处理剂量时，总突变率和正突变率均达到最大，且负突变率低于正突变率．特别是在该剂量下筛选出1株β-胡萝卜素产量达到1.252g/L，比出发菌株1.044 g/L提高了25%的高产菌株BT12-12-05．

通过离子注入对三孢布拉氏霉菌丝长势影响的试验结果(见表1)发现，与真空下未经离子束注入平板培养菌丝长势相比，除14×1015N+/cm2下新生菌落两天后死亡外，其它剂量下菌丝密度均显著增大，尤以12×1015N+/cm2下菌丝密度最高；气生菌丝长度均短于未经离子注入的菌丝体，长势旺盛；菌丝长速均快于未经离子注入的菌丝体，且颜色变黄．

表1 不同剂量氮离子注入对三孢布拉氏霉菌丝长势的影响

2.3 不同剂量氮离子注入对三孢布拉氏霉菌落形态和产孢特性的影响

表2 不同剂量氮离子注入对三孢布拉氏霉菌落形态和产孢特性的影响

与未经离子注入平板培养新生菌落相比，各剂量下平板培养菌落数、菌落半径和产孢特性差异性显著．经离子束处理，除真空对照菌落数变化不明显外，所有剂量下新生菌落数均显著减小，除14×1015N+/cm2剂量下没有产孢，新生菌落培养两天后全部死亡外，所有剂量下在相同的时间均长出一定量褐色的隐性孢子，菌落半径均有增大，特别是8×1015N+/cm2、10×1015N+/cm2和12×1015N+/cm2剂量下差异性更为明显．

2.4 不同剂量氮离子注入对三孢布拉氏霉突变率的影响

将各剂量下通过平板初筛菌落形态和产孢量与出发菌株差异性显著的菌株，经种子培养基培养后，接入发酵培养基逐个摇瓶发酵培养，测定其菌丝体生物量、β-胡萝卜素含量，计算β-胡萝卜素产量．以真空下未经离子束辐照菌株为对照，计算其突变率．

图2 不同剂量氮离子注入对三孢布拉氏霉突变率的影响

图3 β-胡萝卜素高产菌株BT12-12-05的遗传稳定性

2.5 突变菌株的遗传稳定性

为了考察β-胡萝卜素高产菌株BT12-12-05的遗传稳定性，本研究对该菌株进行了连续5代的摇瓶发酵实验．实验结果（见图3）表明，在连续传代5代的实验中，BT12-12-05的发酵水平依然保持在1.200 g/L以上，遗传稳定性良好．

3 结论

本文给出了不同剂量氮离子注入对三孢布拉氏霉存活率、菌丝长势、菌落形态、产孢特性和突变率的影响及突变菌株遗传稳定性实验结果，结果表明：⑴低能氮离子注入三孢布拉氏霉生物学效应显著．随着N+离子注入剂量的增加，三孢布拉氏霉的存活率呈现先减小后增大再减小的“马鞍型”剂量-效应曲线，这被认为是离子注入诱变所特有的诱变效应的重要表现，与一般电离辐射造成的“指数型”剂量-效应曲线不同．与真空下未经离子束注入平板培养菌丝长势相比，除14×1015N+/cm2新生菌落两天后死亡外，所有剂量下菌丝密度均增大、长度减小、长速加快、颜色变黄且长出一定量褐色的隐性孢子，尤以8×1015N+/cm2、10×1015N+/cm2和12×1015N+/cm2更为明显．随着注入剂量的增大三孢布拉氏霉的总突变率和正突变率呈现先增加后减小的变化趋势，以12×1015N+/cm2为处理剂量时，总突变率和正突变率均达到最大，且正突变率高于负突变率．⑵以三孢布拉氏霉负菌孢子为靶材，探索出了一种基于三孢布拉氏霉菌生物学特性的离子束诱变育种方法，在能量15KeV、剂量12×1015N+/cm2的组合参数下，获得了1株β-胡萝卜素产量达到1.252g/L、比出发菌株提高了25%的高产菌株BT12-12-05．这与王连峰等[9]在“阿魏菇多糖高产菌株筛选的离子束诱变和复合诱变对比研究”中以阿魏菇打散菌体为靶材的组合参数相一致，再次说明该能量、剂量组合对于丝状真菌不同靶材的离子束诱变育种都适宜．⑶三孢布拉氏霉菌以其生长迅速生物量高、产β-胡萝卜素能力强等特点展现出很好的工业化应用前景，更可喜的是可通过离子束诱变技术筛选番茄红素环化酶缺失的三孢布拉霉菌株[10]或者在三孢布拉霉菌株发酵过程中加入专一的抑制环化酶活性的化学抑制剂如吡啶类化合物、三孢酸结构类似物获得高产量的番茄红素[11,12]．然而，在三孢布拉氏霉菌发酵生产天然色素的实际应用中，不可回避的存在着菌种退化严重等现实难题，因此，摸索出一种基于三孢布拉氏霉菌生物学特性的离子束诱变育种方法比获得高产菌株更有实用价值，可为三孢布拉氏霉菌工业化生产中持续的菌种改良提供方法学参考．