蛹虫草人工栽培关键技术的研究新进展*

●董 贝 袁园园

(济南市农业科学研究院 山东 济南 250316)

●王建东

(济南市长清区农业局 山东 济南 250399)

●周菡蒂

(济南市植物保护站 山东 济南 250021)

蛹虫草人工栽培关键技术的研究新进展*

●董 贝 袁园园

(济南市农业科学研究院 山东 济南 250316)

●王建东

(济南市长清区农业局 山东 济南 250399)

●周菡蒂

(济南市植物保护站 山东 济南 250021)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又称北虫草，是由虫草菌侵染寄主昆虫的幼虫、成虫或蛹而形成的昆虫尸体与真菌子座的复合体。蛹虫草主要化学成分和药理作用与冬虫夏草相似，具有抗肿瘤、调节免疫力的功效，在哮喘及支气管疾病、肾衰竭病的治疗方面有很好的效果。在国家支持和鼓励下，十年来蛹虫草人工栽培得到很大发展。本文对蛹虫草人工栽培的几个关键技术的研究进行了综述，旨在为我国蛹虫草产业持续健康发展提供支持。

1 蛹虫草菌种的选育

优良菌种对于蛹虫草人工栽培至关重要。通常以菌丝体粗壮、萌发力强、转色快、出草快且均匀作为外观指标，以蛹虫草产量、虫草素、多糖、虫草酸、腺苷等活性成分含量作为品质指标。蛹虫草选育技术手段多样，采用双层平板CR培养基组合，能够筛选出性状优良、活力高的蛹虫草纯种菌株。采用正交设计和双灭活标记方法对冬虫夏草与蛹虫草进行原生质体融合研究，成功获得融合子。王宁等以钩悬法收集蛹虫草单孢子培养单核菌丝，通过杂交成功培育出生物转化率和虫草素含量高的新菌株。袁丽丽等通过高压电晕电场诱变蛹虫草分生孢子，获得了几组与原始菌株拮抗性明显的诱变菌株。

目前辐射诱变育种研究较多，蛹虫草菌种经过航天搭载后，虫草素、虫草酸、腺苷、虫草多糖等活性成分含量较原始菌株都有明显的提高。离子束辐射和亚硝基胍复合诱变能够成功选育出生长指标较原始菌株有显著提高的新菌株。张俊涛等采用CO60-r射线在500Gy条件下辐射蛹虫草菌丝选育的新菌株较原始菌株子实体明显增粗，根数减少，但子实体的重量与原来的相当。

2 蛹虫草栽培方式

目前蛹虫草的人工栽培有3种方式：一是当前生产规模最大的以大米、小麦等为主要原料的固体培养基栽培方式，这种方式以培育蛹虫草子实体为主；二是液体发酵方式，主要用于工业化培育虫草菌的无性型菌丝体或用于虫草素的提取；三是以昆虫幼虫或蛹的活体接种虫草菌培育虫菌复合体。

2.1固体培养基栽培

蛹虫草固体培养基栽培过程包括菌丝体的生长、子实体的分化和生长，与天然蛹虫草较为接近。这种方式成本低、技术简便，但栽培周期较长，生理过程的复杂性使得其对栽培环境的调控要求非常严格。培养基原料以大米、小麦为主，麦粒培养基较大米培养基更适合蛹虫草的生长，麦粒与营养液比例为1∶1.6时蛹虫草出草快、产量高。在培养基pH为6.0、培养温度为20℃的条件下最适合菌丝生长，在培养基pH为5.0、培养温度为26℃的条件下最适合虫草素积累。每天光照16小时，菌丝体转色及原基形成效果好；每天光照12小时，子实体质量好且产量高。王玉和刘晓兰对蛹虫草菌固态发酵生产纤溶酶的适合培养基进行优化后，其纤溶酶活力达167±1U/mL。

2.2液体发酵培养

与固体栽培方式相比，液体发酵培养方式菌丝体产量大，栽培条件简单易控，有利于大量提取与天然蛹虫草有效药用成分相似的化学物质。但经过液体发酵培养后的蛹虫草菌丝体需及时加工或接种，继续保存难度大。液体发酵培养关键技术的研究主要集中在接种量的控制及培养条件的优化方面。接种孢子数在1.5×1010时制作的母种最适合用于蛹虫草液体发酵产菌丝体和虫草菌素。蛹虫草菌丝体生长最适碳源为葡萄糖和蔗糖，最适氮源为蛋白胨和柠檬酸铵，产虫草素的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为牛肉膏。pH 6～7、温度20～25℃的培养条件最适宜菌丝体生长。秦鹏等对蛹虫草液态发酵培养基进行优化，使得菌丝体产率比初始培养基增加了1.73倍，虫草素积累量比初始培养基中增加了1.56倍。狄志彪等研究表明发酵液与菌丝体中虫草素的质量比约为97∶3，改变培养基的种类不会影响总虫草素在发酵液与菌丝体中的分配比。

2.3昆虫活体人工栽培

蛹虫草活体人工栽培可获得与天然蛹虫草子实体最为相似的产品。1986年我国首次成功通过在蚕体上人工接种蛹虫草菌获得了与天然蛹虫草子座相一致的菌虫复合体。经过多年的发展，目前的活体接种方法有喂食法、喷洒法、注射法和穿刺法等。孟楠等用柞蚕5龄幼虫，采用液体菌液针头平行蚕体表注射的方法，在常规条件下培养，感染硬化时间短，可达到批量生产的规模。涂道勇发明了一种使虫草子实体与冬虫夏草一样从桑蚕蛹虫体的头部或尾部出草的新技术。李亚洁等以蓖麻蚕蛹为寄主，采用液体菌种注射大大提高僵化率和出草率。蛹虫草活体培育成本高，条件要求严格，目前仍未实现工厂化生产。

3 添加剂对人工栽培蛹虫草的作用

目前有关蛹虫草人工栽培添加剂的研究主要集中在植物生长调节剂、昆虫激素以及其他在食用菌栽培中使用过的添加剂上。玉米素和吲哚乙酸能够提高虫草多糖含量，加快子座生长。环磷酸腺苷可以增加鲜重，激动素则对干重提高有显著作用。赤霉素和2，4-二氯苯氧乙酸能够促进蛹虫草菌丝体生长，萘乙酸则减慢了菌丝体的生长速率，但适量的萘乙酸能更好地促进虫草菌素的积累。在培养营养液中加入2，4-二氯苯氧乙酸和柠檬酸三胺可缩短蛹虫草的生长周期，提高虫草素含量，加入秋水仙素和链霉素可诱导原基分化，增强培养基的抑菌能力，提高虫草子实体虫草素的含量。浓度为1mg/L三十烷醇能促进蛹虫草生长。房海珍研究了几种新型植物生长调节剂作为添加剂对蛹虫草CM-16生长发育的影响。低浓度的壳寡糖能够提高蛹虫草子座产量和品质，缩短周期；浓度为0.01mg/L的复硝酚钠对菌丝生长最为有利，以3～5mg/L浓度范围内能够加快子座对氮源和碳源的吸收利用，提高产量，同时使超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和丙二醛3种酶活性均达到最高；低浓度的四甲基戊二酸能够刺激子座生长；胺鲜酯在1～3mg/L的浓度范围内，子座的超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、鲜质量和基质利用率等均优于4～6mg/L的浓度范围；氯吡脲在5.0mg/L的浓度时对蛹虫草生长发育最为有利。

4 蛹虫草菌种退化问题

解决菌种退化是蛹虫草人工栽培生产中的核心技术难题，退化使得蛹虫草产量和品质都受到影响。蛹虫草菌种退化涉及了一系列复杂的生化、生理及遗传的过程。

4.1菌种退化的原因

目前关于蛹虫草菌种退化的原因，有基因的突变、核型改变、活性氧的积累及营养供给不足等众多说法。李美娜等研究发现，退化菌株较野生驯化菌株在DNA水平上发生了频率较高的突变。汪虹等通过引物PCR鉴定发现，正常菌株含有两类交配型基因，退化菌株仅仅含有一类交配型基因，推测蛹虫草发生不形成子实体的原因之一是核相发生了改变，即异核体变成了同核体。郑壮丽研究发现退化菌株菌丝体内含有较多活性氧和较高水平的氧化应激。氧化应激使机体处于易损状态，同时能增强致病因素的毒性作用，可导致基因突变。熊承慧将来源于构巢曲霉的谷胱甘肽过氧化物酶基因转化到蛹虫草菌株中进行过量表达，消除了蛹虫草菌种退化的现象。李义勇等研究认为，蛹虫草菌种退化主要原因之一是营养供给不能满足菌体生长要求，以酵母制品为主组分的复合氮源培养基型经优化后，经过3次传代后发酵稳定性保持良好，未出现菌种退化现象。

4.2退化菌种的鉴定

蛹虫草退化的现象在栽培时才体现出来，在生产上常造成资源的浪费，因此对蛹虫草退化菌种的早期检测的研究就显得尤为重要。退化菌株在菌丝体阶段的外部形态能通过镜检区分，正常菌株在见光后渐变为橘黄色，菌丝粗壮、挺立，分生孢子呈念珠状；退化菌株的菌丝体见光后不变色，菌丝纤细、弯曲，孢子粘连在一起呈头状。通过氯化三苯基四氮唑的氧化还原反应对脱氢酶的测定可提早淘汰退化菌株。在蛹虫草孢子培养基中添加指示剂溴麝香草酚蓝进行培养，以孢子培养液的颜色变化或脱色率为指标，能快速鉴定蛹虫草退化菌种。

4.3推迟菌种退化的方法

适宜的保藏和培养条件及减少菌种转管次数能有效延迟菌种退化，子囊孢子分离法和蚕蛹回接法能有效对菌种进行复壮。蛹虫草菌种在4℃恒温保存，保藏培养基加0.5%的琼脂，用无菌胶塞代替棉塞，且每半年活化一次有利于延长菌种保藏时间。左雪枝研究发现组织分离法更适合遗传和保持母本性状，子囊单孢子配对法更适合筛选更优菌株。

5 病虫害防治

在蛹虫草人工栽培过程中常有病虫害发生，病原物主要有细菌、真菌、螨、蚊、蝇及跳虫等。发生病害，常造成培养基变质，菌丝体不能正常生长。害虫以取食菌丝或子实体为主，螨不仅直接取食菌丝、蛀食培养料，而且携带并传播病源杂菌。蚊蝇以幼虫取食培养料和菌丝，从而影响菌种定植蔓延，造成发菌困难。

蛹虫草病虫害防治应遵循预防为主、防治结合的综合防治措施。认真做好环境场所和栽培各环节的清洁消毒工作，发现污染应及时清除污染源，防止蔓延；当子实体成熟时应及时采收，避免病虫害的发生。温度低于24℃、湿度在75%～80%、pH在7.0～7.5范围内，可有效抑制致病深绿木霉的发生。1000倍液的辛硫磷加杀螨剂防治螨类效果较好。以大米、蚕蛹粉、蛋白胨等作培养基，加上适当的磷酸二氢钾、硫酸镁、VB等可提高蛹虫草的抗病虫能力。

6 问题与展望

目前，我国蛹虫草人工栽培虽已实现工业化生产，但在一些关键环节上仍存在问题。一是由于蛹虫草菌种易退化，加之各地栽培方法的差异，蛹虫草的品质存在不稳定性，缺乏统一指标；二是在人工栽培蛹虫草的过程中添加剂的使用剂量问题，食用和药用安全性难以得到保障；三是目前蛹虫草人工栽培缺少专业的发酵设备。蛹虫草菌丝体液体发酵后期粘度大、耗能高，普通的生物发酵罐难以满足需要，要保证整个生长周期不被污染，需要研发专门的设备。

人工栽培的蛹虫草作为冬虫夏草的替代产品，有着很高的保健和医用价值，市场潜力巨大。但是蛹虫草菌种退化问题一直是阻碍蛹虫草人工栽培的一大瓶颈，关于蛹虫草生长代谢等相关基因和蛋白的研究有助于揭示蛹虫草菌种退化机理，对蛹虫草活性成分的挖掘有着深层意义，进而选育出高产、稳定的优良菌种，这对未来蛹虫草栽培的研究及虫草产业发展有着重要意义。

济南市农业科技创新项目(201312)。