艾灸对阿尔茨海默病模型大鼠海马形态学的影响

王述菊 马 骏 孙国杰 沈 峰 李 熙 万博鹏

(湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)



艾灸对阿尔茨海默病模型大鼠海马形态学的影响

王述菊 马 骏 孙国杰 沈 峰 李 熙 万博鹏

(湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)

目的 探讨艾灸治疗对阿尔茨海默(AD)模型大鼠海马组织形态学的影响。方法 健康雄性15个月龄SD大鼠40只，随机分为正常组、假手术组、模型组、艾灸组，每组10只。采用双侧海马一次性注射聚集态β淀粉样蛋白(Aβ)25～35制备AD大鼠模型，造模完成后第 2天开始进行艾灸治疗，在大鼠“肾俞”、“足三里”、“百会”上方2～3 cm处温和灸。每日治疗1次，每穴艾灸5 min，6 d为1疗程，休息1 d后继续下1个疗程，共治疗3个疗程。HE 染色及透射电镜观察大鼠海马CA1区神经细胞结构的形态学变化。结果 HE 染色观察结果显示，模型组大鼠海马CA1区神经细胞数量较正常组和假手术组明显减少，神经细胞受损缺失，细胞核固缩。运用艾灸治疗后，大鼠海马CA1区神经细胞核固缩现象明显改善，形态较规则，排列较整齐。透射电镜观察结果显示，Aβ在大鼠脑内能引起海马CA1区神经细胞的退行性改变，神经元体积缩小，形态不规则，线粒体肿胀，基质清淡、有空泡，数目减少，还可见到线粒体嵴呈畸形样改变，内质网扩张，脂褐素沉积增多。运用艾灸治疗后，大鼠海马CA1区神经细胞水肿明显减轻，内质网扩张明显改善，线粒体肿胀明显减轻。结论 艾灸治疗可促进神经细胞的修复，艾灸对AD模型大鼠海马神经细胞的退行性改变有明显改善作用。

阿尔茨海默病；Aβ25～35；艾灸；海马；形态学

阿尔茨海默病(AD)临床上主要表现为记忆能力、判断能力、学习能力、思维能力、认知能力以及行动能力、生活自理能力普遍下降，给患者生活质量和家庭生活都带来了困扰。AD 的主要病理特征是神经元的选择性丢失及因超磷酸化Tau蛋白和β淀粉样蛋白(Aβ)在神经元内外的异常积聚而分别形成的神经元纤维缠结(NFT)和老年斑(SP)，Aβ沉积是AD发病的主要致病因素〔1，2〕。本实验采用双侧海马一次性注射聚集态Aβ25～35制备AD大鼠模型，运用艾条温和灸“肾俞”、“足三里”、“百会”进行治疗，HE 染色及透射电镜观察艾灸治疗对大鼠海马CA1区神经细胞的形态学变化。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性15个月龄SD大鼠40只，体重350～450 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供〔合格证:SCXK(鄂)2010-0009〕。先进行Y型水迷宫筛选〔3〕，淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠，将合格大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、艾灸组，每组10只。

1.2 主要仪器及试剂 ES-2100S电子天平(长沙湘平科技发展有限公司)，Y型水迷宫(中国医学科学院药物所)，DW-5脑立体定位仪(成都泰盟科技有限公司)，台式牙钻机(成都康发医疗器械有限公司)，Sartorius分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，5 μl微量进样器(上海安亭微量进样器厂)，TB-718E 型生物组织自动包埋机(湖北泰维医疗科技有限公司)，轮转式石蜡切片机(德国Leitz公司)，日产 Olympus 光学显微镜，LEICA ULTRACUTUCT超薄切片机(德国)，FEI Tecnai G212透射电镜(荷兰)，Aβ25～35(美国sigma公司)，1%锇酸、2.5%戊二醛(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 造模方法 先进行Aβ25～35孵育，将Aβ25～35用无菌生理盐水稀释成5 μg/μl，密封后放在 37℃培养箱中孵育1 w，老化成具有毒性的聚集状态，然后放在4℃冰箱中保存备用。

AD大鼠模型制备采用脑立体定位仪下给予双侧海马一次性注射聚集态Aβ25～35〔4〕。大鼠用10%水合氯醛(40 mg/100 g体重)腹腔注射进行麻醉，前后囟保持在同一水平将鼠头固定在脑立体定位仪上，消毒后剪开头皮，定位海马区〔5，6〕(前囟后3.5 mm，中线旁开2.0 mm，硬脑膜下2.7 mm)，左右两侧海马区定位完成后，用台式牙钻机在此钻一直径1 mm的小孔，微量进样器垂直插入，每侧缓慢注射Aβ25～35聚集液1 μl，为了使Aβ25～35聚集液充分浸润局部组织，注射完毕后留针5 min再缓慢拔针。完成后马上缝合头皮，术后每天肌肉注射青霉素10万U/只，连续注射5 d。

1.4 各组处理方法 ①艾灸组：造模完成后第2天开始进行艾条温和灸治疗。穴位选取参照华兴邦等制定的《大鼠穴位图谱的研制》〔7〕，采用自制的直径约8 mm艾条，在大鼠“肾俞”、“足三里”、“百会”穴上方2～3 cm处温和灸。“肾俞”位于第2腰椎下两旁，“足三里”位于膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处，“百会”位于顶骨正中。“肾俞”、“足三里”穴左右隔日交替使用。每日艾条温和灸治疗1次，每穴艾灸5 min，6 d为1个疗程，休息1 d后继续下1个疗程，共治疗3个疗程。②模型组：按照前述造模方法制备AD大鼠模型，造模完成后大鼠每日与艾灸组大鼠相同时间相同方法进行抓取、固定，但不进行艾条温和灸治疗。③假手术组：脑立体定位仪下双侧海马区注射等量生理盐水，其他操作同模型组。④正常组：同步喂养，不做任何处理。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 HE 染色观察 行为学检测完成后第 2 天，随机在每组取4只大鼠进行HE染色观察。大鼠用10%水合氯醛按照40 mg/100 g体重进行腹腔注射麻醉，先用0.9%生理盐水迅速灌注，再用4%多聚甲醛灌注固定。断头快速取脑组织，在视交叉平面前后4 mm处将脑组织冠状面切开，留取中间部分放置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定过夜。将固定后的脑组织常规上行脱水、二甲苯透明后进行石蜡包埋，蜡块连续冠状切片，进行 HE 染色。

1.5.2 透射电镜观察 行为学检测完成后第 2 天，随机在每组取4只大鼠用10%水合氯醛按照40 mg/100 g体重进行腹腔注射麻醉，先用0.9%生理盐水快速灌注，再用2.5%戊二醛磷酸缓冲液灌注固定，断头快速取脑组织，然后分离出海马组织。2.5%戊二醛固定，磷酸缓冲液清洗，1%锇酸后固定，丙酮脱水，环氧丙烷浸透，环氧树脂包埋，聚合后超薄切片机切片，透射电镜观察并摄片记录。

2 结 果

正常组和假手术组大鼠海马CA1区神经细胞形态完整，排列整齐。模型组大鼠海马CA1区神经细胞数量较正常组和假手术组明显减少，神经细胞受损缺失，细胞核固缩，核仁欠清晰。艾灸组大鼠海马CA1区神经细胞核固缩现象明显改善，形态较规则，排列较整齐，见图1。

透射电镜观察结果显示：正常组和假手术组大鼠海马CA1区神经细胞形态完整，结构清楚，排列整齐。模型组大鼠海马CA1区神经元体积缩小，形态不规则，线粒体肿胀，基质清淡、有空泡，数目减少，还可见到线粒体嵴呈畸形样改变，内质网扩张，脂褐素沉积增多。艾灸组大鼠海马CA1区神经细胞水肿明显减轻，内质网扩张及线粒体肿胀明显改善，高尔基体、线粒体、核糖体数目较模型组明显增多，见图2。

图1 各组大鼠海马CA1区HE 染色观察图(HE，×200)

图2 各组大鼠海马CA1区透射电镜观察图(标尺=0.5 μm)

3 讨 论

中医学认为，AD的病位在脑，其病理性质为本虚标实〔8～10〕。本虚主要在于肾精亏虚，髓海不足，肾精亏虚是老年性痴呆的发病根本，老年性痴呆的发生与髓海不足有密切关系，而《素问·逆调论》中的“肾不生，则髓不能满”说明了髓海不足的根源在于肾虚不生。其标实在于痰浊、瘀血蒙蔽脑窍，痹阻脑络，且与五脏都有着重要关系。人体脏腑功能失调，气血津液运行失常，体内的痰浊、瘀血日久化为浊毒，浊毒损伤脉络可致脑窍失养、神机不明而发为痴呆〔11〕。何珊等〔12〕运用脏腑辨证中的五脏理论概括AD的中医病机，认为肾虚髓减是痴呆发病的重要因素，肝肾阴虚，脾肾不足，心脾气血两虚均可致痰浊、湿气、瘀血、郁火阻滞脑络，闭塞脑窍而发痴呆，亦可从肺论治，若肺气宣发肃降、通调水道不利，则难免产生痰浊、瘀血而发病。西医学认为，AD典型的病理改变是Aβ淀粉沉积物和SP的形成以及细胞内NFT和神经元细胞数目减少、神经胶质细胞的炎性改变〔13〕。Aβ的聚集引起了神经细胞的功能紊乱和死亡，最终导致痴呆〔14〕。Aβ纤维沉积的危害，主要表现在以下几个方面〔15〕：①Aβ能够通过线粒体途径，导致线粒体内过氧化环境的产生，加重了细胞器的损伤，从而引起细胞凋亡；②Aβ可能参与了炎症反应，起到了炎性介质的作用，Aβ的累积促成了AD患者病灶处炎性反应的强度，同时激发NFT的形成。

海马是中枢神经系统中参与学习和记忆贮存的重要器官，与学习记忆认知活动密切相关〔16，17〕。研究发现AD 患者的海马体积出现明显的萎缩，海马的体积和径线长度都相比正常人有所减小〔18〕。实验研究〔19，20〕将Aβ25～35聚集液一次性注入大鼠双侧海马造模后，AD 大鼠出现了学习记忆功能障碍，证实了作为学习记忆重要结构的海马组织遭到破坏。针灸因其适应证广泛、操作运用简单、安全无毒副作用等优点，引起医学界的高度关注，针灸在临床上治疗AD疗效亦得到充分肯定。艾灸法以其药物作用和温热刺激，可温经通络、活血化瘀，软坚散结、温肾健脾，益气补阳、回阳固脱，扶正祛邪，对慢性病及经络痹阻、阳气虚寒者尤为适宜。本实验选用“肾俞”、“足三里”、“百会”艾条温和灸治疗。肾精亏虚为AD发病之本，肾俞是肾脏精气输注于背部的重要腧穴，为肾之背俞穴，艾灸肾俞有调理脏腑，补益肾精之功。痰浊瘀血痹阻是AD发病之标，而痰浊、瘀血的产生与脾胃运化失常有关。脾胃乃后天之本，气血生化之源，有腐熟水谷，运化水湿之功。足三里是胃腑下合穴，艾灸足三里可健脾和胃，补益气血，脾胃健运则可蠲化痰浊，疏散瘀血。百会位于巅顶，是督脉重要腧穴，而督脉与脑、肾有密切关系，艾灸百会是近治作用选穴，具有益肾补脑，调督醒神之功。

本实验结果表明艾灸治疗可促进神经细胞的修复，艾灸对AD模型大鼠海马神经细胞的退行性改变有明显改善作用。

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〔2015-05-22修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

湖北省教育厅科学技术研究项目(Q20101803)；武汉市科技局青年科技晨光计划项目(201150431126)

马 骏(1964-)，女，教授，医学博士，主要从事针灸防治脑病及神经系统疾病的研究。

王述菊(1977-)，女，副教授，医学博士,主要从事针灸防治脑病及神经系统疾病的研究。

R245

A

1005-9202(2016)20-4993-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.022