激活Notch信号的骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死模型鼠炎性因子与心功能的影响

朱玲军 项美香 王建安

(浙江大学医学院附属第二医院心血管内科，浙江 杭州 310009)



激活Notch信号的骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死模型鼠炎性因子与心功能的影响

朱玲军 项美香 王建安

(浙江大学医学院附属第二医院心血管内科，浙江 杭州 310009)

目的 探讨激活Notch信号的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对心肌梗死(MI)模型鼠炎性因子与心功能的影响。方法 66只Wistar 大鼠通过结扎冠状动脉前降支(LAD)制作MI模型，其中60只建模成功，2 w后再将其随机分为激活Noth 信号的MSCs 移植组、MSCs 移植组、培养液移植组及MI 模型组，即E、D、C、B组，每组各15只，分别采取相应的处理。另选取10只Wistar大鼠作为对照组(A组)，给予假手术处理。移植后4 w，所有大鼠均行超声心动图检查及心脏组织免疫组织化学染色，测量大鼠各项心功能指标及炎性细胞因子表达情况，并进行比较。结果 移植4 w后，B、C、D、E组大鼠的LVEF、LVFs较A组降低，LVDd、LVDs较A组增高；而E组大鼠的LVEF、LVFs则较B、C、D组增加，LVDd、LVDs较B、C、D组降低(P<0.05)。B、C、D、E组大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均较A组明显增加，而E组大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平较B、C、D组明显降低(P<0.05)。结论 MSCs移植既能改善MI大鼠的心功能，又能使炎性因子表达水平明显下调，尤以激活Notch信号的MSCs移植效果更佳，表明Notch信号激活可促进MSCs移植作用。

Notch信号；骨髓间充质干细胞；心肌梗死；心功能

骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种具有自我更新、分化增殖和多向分化潜能的成体干细胞，对损伤组织的再生及修复十分有帮助；此外，MSCs还具有来源丰富、取材方便等优点，广泛用于急性心肌梗死(MI)的治疗〔1〕。多数学者的研究发现，急性MI经MSCs移植治疗后，不仅心肌瘢痕明显减少，且心室重构也明显抑制，故心功能得到改善〔2〕。MI后心室重构的发生和发展与机体的免疫炎症反应密切相关，出现高表达的炎性细胞因子。许多体内外研究显示MSCs的免疫学特性较为独特，能对多种免疫细胞的功能进行调节，并在相关炎性细胞因子的表达中起调节作用，故MSCs移植可调节心肌梗死后炎症反应〔3〕。Notch 信号是对细胞命运起关键作用的一种信号通路，主要参与细胞与细胞之间直接作用。已有报道显示，在MSCs的分化中，Notch信号具有很好的调控作用，故Notch信号的激活参与MSCs移植后生物学功能的发挥〔4〕。本研究拟观察激活Notch信号的BMSCs移植对MI后心功能及炎性因子表达的影响。

1 资料与方法

1.1 材料 美国Hyclone 公司生产的DMEM/F12 培养液，美国Roche 公司生产的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，克隆人Notch1 ICN基因构建逆转录病毒载体(pLXSN-ICN)，武汉博士的公司提供的兔抗大鼠多克隆抗体白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体。

1.2 实验动物及分组 选取实验动物中心提供及培养的76只质量为200～250 g的Wistar 大鼠作为实验对象，雌雄各半，选取其中10只进行假手术处理，作为对照组；66只进行MI模型的建立，共60只成活，按随机数表法将其分为B、C、D、E四组，每组各15只，分别给予不同的处理，B组仅为MI模型，未给予其他处理，C组进行培养液移植，D组进行MSCs 移植，E组进行激活Noth 信号的MSCs 移植。

1.3 建立大鼠MI模型 MI模型的建立采用结扎冠状动脉左前降支(LAD)的方法进行。先称重，再腹腔内注射麻醉，麻药选取30 g/L戊巴比妥钠，剂量为1.5 ml/kg。麻醉后将大鼠固定在操作台上，消毒颈、胸部手术区域，行气管切开后气管插管并与呼吸机连接。选择左前第3～4肋间隙距胸骨左缘4～5 mm处进行开胸手术，手术在心电图监护下完成，心包打开后心脏暴露出来，在左心耳尖3～4 mm处对LAD进行结扎处理。结扎完毕后观察心电图变化，若出现R波振幅升高、ST段弓背向上抬高，即可说明MI模型建立成功。结束操作后逐层关闭胸腔并缝合，自主呼吸恢复后撤离呼吸机并拔除气管插管，术后给予抗感染治疗，放入无菌、恒温笼中饲养。

1.4 MSCs的分离培养及标记 脱颈处死雄性Wistar大鼠并置于75%酒精中浸泡15 min，在无菌条件下将股骨和胫骨分离取出，并将周围的肌肉组织完全剔除干净。采用DMEM/F12培养液对骨髓腔进行反复冲洗，并将得到的细胞悬液放入培养瓶中进行接种，置于孵箱内培养，培养条件为37℃、5%CO2。培养72 h后，换掉培养瓶中的培养液将未贴壁细胞去除，之后换液每2 d进行1次。待瓶底80%被贴壁细胞覆盖时采用0.25%的胰酶进行消化，并传代，将3～6代大鼠MSCs细胞收集起来。在移植前对细胞进行标记，将无菌DAPI，50 mg/L加入重悬细胞中进行孵育，37℃下30 min，完成后采用磷酸盐缓冲液(PBS)进行离心洗涤，共6次。

1.5 构建重组pLXSN-ICN 采用克隆人Notch1 ICN 基因进行pLXSN-ICN的构建，载体构建完成转染到MSCs细胞中。

1.6 MSCs 移植 MI模型建立2 w后，于原切口开胸进入，用微量注射器吸取细胞悬液0.2 ml(细胞总数为1 ×106)并沿梗死区与正常心肌交界处多点注射到左心室前壁。培养液移植组采用同样的方法进行心室内移植，但注入的是不含细胞的等量DMEM 培养液；假手术组以同样的方法将等量DMEM 培养液多点注射到心前壁。

1.7 心功能检测 移植4 w后，在麻醉状态下，采用Sequoia 512型超声仪对大鼠进行心脏超声检查，探头频率为10 MHz，超声检查下可获得胸骨旁左室长轴和乳头肌水平短轴切面，对左心室舒张末径(LVDd)、收缩末径(LVDs)、左室射血分数(LVEF)及短轴缩短率(LVFS)等指标进行测量。

1.8 免疫组织化学检测 心功能检测完毕后，迅速开胸取出心脏，将其表面的包膜及脂肪组织清除掉，并用冰盐水冲洗，冲洗干净后对标本进行固定，置于40 g/L甲醛溶液中24 h，24 h后依次进行脱水、透明、浸蜡、常规石蜡包埋及连续切片等处理，切片厚度保持在3 μm，分别使用抗IL-1β 、IL-6 、TNF-α抗体对石蜡切片进行免疫组织化学染色，操作严格按照说明书上的步骤进行。在光学显微镜下对切片进行观察，若细胞质出现棕黄色，即为阳性(+)表达的细胞。每张切片在显微镜下随机选取10个视野计算阳性率，并取平均值。

1.9 观察指标 检测各组大鼠移植4 w后的心功能指标及心肌炎性因子表达情况，指标包括LVEF、LVDd、LVDs、LVFS、IL-1β、IL-6、TNF-α。

1.10 统计学方法 应用SPSS13.0软件，计量资料两组间比较采用t检验，多组间差异比较采用方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠术后4 w心功能指标的比较 术后4 w，与A组比较，B、C、D、E组大鼠的LVEF、LVFS均明显下降，以E组的下降幅度最小；B、C、D、E组大鼠的LVDd、LVDs均明显增加，以E组的增加幅度最小(P<0.05)。与B、C、D三组相比，E组的LVEF、LVFS明显增加，而LVDd、LVDs明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠术后4 w心功能指标的比较±s)

2.2 各组大鼠术后4 w炎性因子的表达情况比较 术后4 w，与A组比较，B、C、D、E组大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均明显增加，以E组的增加幅度最小(P<0.05)。与B、C、D三组相比，E组的IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠术后4 w炎性因子的表达情况比较±s)

3 讨 论

MI对人类健康的威胁较大，心肌细胞一旦出现损害将无法修复和分化，并被成纤维细胞取代，最终改变心脏结构导致心力衰竭的发生。心肌细胞的减少及心室重构均不能从根本上通过药物治疗及冠状动脉血运重建术得到改变，但干细胞移植治疗则能有效改善这一点，外源性干细胞植入心肌后可再生为具有正常功能的心肌细胞，对瘢痕组织的形成具有很好的抑制作用，从而使心功能得以改善〔5〕。MSCs是一种可分化为多种细胞的多能干细胞，不仅能多向分化、自我更新、大量增殖，还具有体外易培养、获取方便等优点，因此在MI干细胞移植治疗中的应用前景较好。

研究证实，在BMI的治疗中MSCs 移植已经取得了很好的效果〔6〕。目前，临床上已证实MSCs 移植MI心功能的改善是通过向心肌细胞分化、促进血管生成及改善心肌重构等机制来完成的，但尚未清楚其确切治疗机制，仍存在一定的争议〔7〕。本研究表明心肌缺血损伤后大鼠的心功能显著恶化，但MSCs移植组大鼠各项心功能指标较MI模型组、培养液移植组改善更加明显，这一结果提示MSCs移植对BMI后心功能的改善十分有效。多数学者认为MSCs移植对心功能的改善可能与其向心肌细胞分化、分泌多种生长因子以促进细胞增殖和血管新生以及抑制心肌细胞凋亡等机制有关〔8〕。

MI常伴一定程度的免疫炎症反应，心肌组织中炎性细胞因子的异常表达可在神经内分泌激活的共同作用下对MI发生发展起促进作用，可推动心室重构。近年来多项研究证实，在MI的发生发展中炎症细胞因子起着十分重要的作用，其中IL-1β、IL-6、TNF-α被证实为是参与MI心室重构的重要炎性因子。上述炎性因子在正常心肌组织中较少表达，仅在心肌缺血损伤时出现高水平表达，因此，可通过抑制上述炎性因子的表达来延缓心室重构。国内外大量研究显示，MSCs移植除了能向心肌细胞分化、改善心室重构外，还具有独特的免疫抑制特性，移植后可抑制免疫和调节炎症反应〔9〕。本研究结果表明在MI发生发展中免疫细胞因子起着十分重要的作用，MSCs 移植可通过对上述炎性因子的抑制作用而起到对MI的治疗作用。这与相关文献〔10〕报道一致。这是由于炎性细胞因子表达水平的抑制可减少负性肌力作用，有助于心肌重构的缓解，从而改善心功能。

Notch信号在多细胞生物(如果蝇、哺乳动物等)的发育过程中起关键调控作用，可参与几乎所有涉及细胞分化的生命活动。目前，关于MSCs分化特性的研究较多，但少有文献报道其分化机制〔10〕。有学者的研究采用克隆人Notch1 ICN 基因构建pLXSN-ICN，并将ICN基因通过逆转录病毒介导转染到大鼠MSCs中，对MSCs分化情况的观察结果显示，Notch1可在MSCs中表达，提示在MSCs的增殖分化中Notch信号具有调控作用。本研究表明激活Notch 信号的MSCs移植对心功能的改善效果更好。这与激活的Notch 信号转染MSCs后促进其向心肌细胞分化的作用有关。而心肌炎性细胞因子检测结果显示，激活Notch 信号的MSCs移植可更好的调节MI后出现的免疫炎症反应，从而抑制心室重构。这是由于Notch信号可调控MSCs的增殖分化，通过促进MSCs移植对抗炎与促炎细胞因子表达平衡的调节而对MI后免疫炎症反应进行调节，从而有助于心功能的改善。

1 马树人，谢雄伟.激活Notch信号的骨髓间充质干细胞移植促心肌梗死模型鼠血管新生研究〔J〕.苏州大学学报(医学版)，2011；31(1)：93-7.

2 谢雄伟，马树人.激活Notch信号的骨髓间充质干细胞心肌移植促进血管新生〔J〕.江苏医药，2011；37(14)：1623-6.

3 杨昕蕾，姜春明，孙唐娜，等.骨髓间充质干细胞移植对异丙肾上腺素致心力衰竭大鼠心功能及炎性细胞因子表达的影响〔J〕.现代生物医学进展，2014；14(2)：235-9.

4 Lai PF，Panama BK，Massé S，etal.Mesenchymal stem cell transplantation mitigates electrophysiological remodeling in a rat model of myocardial infarction〔J〕.J Cardiovasc Electrophysiol，2013；24(7)：813-21.

5 Karpov AA，Uspenskaya YK，Minasian SM，etal.The effect of bone marrow-and adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation on myocardial remodelling in the rat model of ischaemic heart failure〔J〕.Int J Exp Pathol，2013；94(3)：169-77.

6 Lin JT，Wang JY，Chen MK，etal.Colon cancer mesenchymal stem cells modulate the tumorigenicity of colon cancer through interleukin 6〔J〕.Exp Cell Res，2013；319(14)：2216-29.

7 Moon HH，Joo MK，Mok H，etal.MSC-based VEGF gene therapy in rat myocardial infarction model using facial amphipathic bile acid-conjugated polyethyleneimine〔J〕.Biomaterials，2014；35(5)：1744-54.

8 李小林，范忠才，白 雪，等.骨髓间充质干细胞移植心肌梗死大鼠的心功能〔J〕.中国组织工程研究，2013；17(10)：1761-5.

9 王海萍，张 雷，赵 静，等.大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的实验研究〔J〕.中国临床解剖学杂志，2012；30(2)：209-13.

10 乔建晶.自体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后心功能不全家兔炎性因子表达的影响〔D〕.石家庄：河北医科大学硕士论文，2011.

〔2015-10-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

浙江省卫生厅课题(No.2015KYB164)

朱玲军(1977-)，男，主治医师，硕士，主要从事心血管内科方面的研究。

R54

A

1005-9202(2016)19-4707-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.015