新型肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞抑制作用的影响

任吉祥 刘 爽 孙 洋 周庆伟

(长春中医药大学附属医院神经内科，吉林 长春 130021)



新型肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞抑制作用的影响

任吉祥 刘 爽1孙 洋1周庆伟2

(长春中医药大学附属医院神经内科，吉林 长春 130021)

目的 探讨新型肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞增殖及Caspase-3蛋白表达的影响。方法 采用CCK-8检测不同浓度的新的肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞增殖并用Western印迹检测对Caspase-3蛋白的表达。结果 新的肿瘤抑素作用C6胶质瘤24 h空白对照组与卡莫司汀组比较差异有显著性(P<0.05)，与其他实验组比较差异均无统计学意义(P>0.05);48 h空白组与卡莫斯汀组、1 500、2 000 μg/ml组比较有统计学差异(P<0.05)；72 h时空白对照组与卡莫斯汀组、1 500、2 000 μg/ml组比较有统计学差异(P<0.05)。空白对照组与卡莫司汀组、1 500、2 000 μg/ml组比较Caspase-3蛋白表达有统计学差异(P<0.05)。结论 新型肿瘤抑素可能通过调控Caspase-3蛋白表达抑制C6肿瘤细胞增殖。

新的肿瘤抑素；C6神经胶质细胞瘤

研究表明，胶质瘤常浸润人脑重要功能区或附近区域，手术无法将肿瘤完全切除，术后易复发，放、化疗虽可杀伤肿瘤细胞，但同时亦会损伤部分正常脑组织，会出现严重的全身不良反应，临床治疗效果不佳〔1〕。生物活性肽是一类活性较高的化合物，因其结构简单、分子量小，易透过血管屏障等特点，甚至能够通过细胞渗透直接进入细胞内，克服了目前很多药物不能直接进入细胞内等问题〔2，3〕。本文探讨新的肿瘤抑素对胶质瘤细胞的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料 C6神经胶质瘤细胞(购自中国科学院上海细胞生物学研究所),卡莫司汀(中国天津金耀药业有限公司，批号：1407011)。DMEM细胞培养基、胎牛血清、TRIS-base、Bis Acrylamide、Acrylamide、Glycine、Bradford蛋白质定量试剂盒、兔抗-caspase-3、HRP 羊抗兔IgG、抗β-actin(武汉博士德生物工程有限公司)；CCK-8溶液(碧云天生物技术研究所)。倒置光学显微镜 NiKon ECLIPSE 80i(日本尼康公司)；二氧化碳培养箱(日本三样电机株式会社制造，产品型号：NCO-15AC)；AN YANG 超净台(苏州安洋科技发展有限公司，型号：BSC-BOOⅡB2)；酶联免疫检测仪(中国北京普朗新有限公司，DNM-9602)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8检测不同浓度的新型肿瘤抑素对C6神经胶质瘤增殖的影响 取对数期细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，细胞计数调整至1×104/ml；接种至96孔板；实验随机分为空白对照组、卡莫司汀组(0.391 mg/ml)、新型肿瘤抑素(1 000、1 500、2 000 μg/ml)组,每组设4个复孔，细胞贴壁后，除空白对照组外，每组加入不同的药物，37℃、5%CO2孵育；分别在加药24、48、72 h时每孔加入CCK-8溶液20 μl，放置孵箱孵育1 h后，采用酶标仪检测OD值。

1.2.2 Western印迹检测不同浓度的新的肿瘤抑素对Caspase-3蛋白表达的影响 取对数期细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，细胞计数调整为3×105/ml，细胞接种至6孔板，随机分为空白对照组、卡莫司汀组(0.391 mg/ml)、新型肿瘤抑素(1 000、1 500、2 000 μg/ml)组,每组设4个复孔，细胞贴壁后，除空白对照组外，每组加入不同浓度的药物，置37℃，5%CO2孵育，孵育48 h取出6孔板，提取蛋白；电泳后，在恒定电流200 mA条件下转膜90 min；转膜结束后用5%脱脂奶粉常温摇床封闭1 h；弃去封闭液，加入一抗(1∶300稀释)；置于4℃孵育过夜；TBST洗膜15 min，共3次；加入二抗(1∶3 000稀释)，常温摇床摇1 h；TBST洗膜15 min，共3次；加入显影液；用凝胶图像处理系统分析检测目的蛋白Caspase-3表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS18.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 CCK-8检测不同浓度的新型肿瘤抑素对C6神经胶质瘤增殖的影响 24 h时只有空白对照组与卡莫司汀组比较有显著差异(P<0.05)，与其他组比较均无统计学意义(P>0.05)，其余组间比较也无统计学意义(P>0.05)：48 h时空白对照组与卡莫斯汀组、1 500、2 000 μg/ml组比较有统计学意义(P<0.05)；72 h时空白对照组与卡莫斯汀组、1 500、2 000 μg/ml组比较有统计学意义(P<0.05)。见图1,表1。

图1 各时间C6神经胶质瘤增殖镜下改变(×10)

表1 CCK-8检测不同浓度的新型肿瘤抑素对C6神经胶质瘤增殖的影响

与空白对照组比较：1)P<0.05；与卡莫司汀组比较：2)P<0.05

2.2 Western印迹检测不同浓度的新型肿瘤抑素对Caspase-3蛋白表达的影响 卡莫斯汀组(1.53±0.01)、1 500 μg/ml(0.96±0.00)、2 000 μg/ml新型肿瘤抑素组(0.50±0.01)Caspase-3蛋白表达均有所下调，与空白对照组(2.09±0.01)比较有显著差异(P<0.05)。1 000 μg/ml新型肿瘤抑素组Caspase-3表达量为1.33±0.01。

3 讨 论

肿瘤细胞与正常细胞在很多生物学特性上都很相似,当药物作用于肿瘤细胞时,通常正常细胞也会受到很大的影响。选择性抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞进入凋亡途径是目前癌症研究的热点和主流。肿瘤细胞是一类代谢率高且生长迅速的细胞，在肿瘤细胞中,很多与细胞增殖和迁移相关的通路都被过度激活,这提示在肿瘤细胞中存在大量可供选择的位点〔4〕。本研究表明作用48 h新形肿瘤抑素对C6神经胶质瘤细胞生长有抑制作用并成一定的剂量依赖性。Caspase-3 是介导细胞凋亡的一类蛋白水解酶是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶，参与细胞凋亡的级联反应，在胶质瘤的恶性进展中也发挥重要作用〔5〕。Caspase-3需在活化状态下能参与细胞凋亡〔6〕。Caspase-3蛋白酶激活机制非常复杂,受多种因素调控,存在不同的活化途径。本实验结果显示，卡莫斯汀组、新型肿瘤抑素1 500、2 000 μg/ml组均能显著下调Caspase-3蛋白表达，说明小分子肽可能通过抑制Caspase-3蛋白表达从而抑制肿瘤细胞生长。

1 张婧婧.Angiopep-2介导的双靶向纳米载体的研究及其在大鼠C6胶质瘤MR显像中的价值〔D〕.合肥：安徽医科大学,2015.

2 何平均，倪淑欣，王文权，等.抗肿瘤寡肽类药物研究进展〔J〕.中国医药生物技术，2009;4(4):288-90.

3 邱晓燕.抗菌肽的免疫功能和应用前景〔J〕.生物学通报，2002;37(1):24-5.

4 瞿家桂.神经胶质瘤细胞致瘤性相关基因、抗肿瘤药物以及健康人群认知功能的研究〔D〕.合肥：中国科学技术大学,2014.

5 蔡风景,徐朝阳,陈峻严,等.雷公藤甲素对C6胶质瘤细胞凋亡及TNF-α、NF-κb和Caspase-3表达的影响〔J〕.中药药理与临床,2013(6):14-7.

6 吕 军,杨连粤.Caspase-3与肝癌细胞凋亡〔J〕.华夏医学,2004;17(5):839-41.

〔2016-05-13修回〕

(编辑 郭 菁)

1 吉林大学药学院 2 吉林大学再生医学研究所

周庆伟(1959-)，男，教授，主要从事药理学研究。

任吉祥(1977-)，男，副教授，主要从事中医内科脑病临床研究。

R73

A

1005-9202(2016)19-4705-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.014