BRCA1、Ki67在不同分子分型乳腺癌中的表达及临床病理意义

张 科 梅金红 蔡 勇 王立超



BRCA1、Ki67在不同分子分型乳腺癌中的表达及临床病理意义

张 科 梅金红 蔡 勇 王立超

目的 探讨BRCA1、Ki67在不同分子分型乳腺癌进展中的作用、临床病理意义。方法 应用荧光原位杂交技术(FISH)，对免疫组化方法检测Her2为2+以上(包含2+)的肿瘤蜡块做进一步检测，FISH检测出阳性表达的肿瘤蜡块定义为Her2最终阳性表达，并依据《2013版中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范的标准》对乳腺浸润性导管癌进行分子分型，依据分子分型将乳腺癌分为五类Luminal A型，Luminal B like型，Luminal B样型，Her2过表达型和基底细胞样型，各分型分别选取20例，总共100例乳腺浸润性导管癌病例。采用免疫组化二步法对入选病例的肿瘤组织进行BRCA1及Ki67蛋白的检测。结果 BRCA1蛋白阳性表达率在Luminal A型组，Luminal B like型组，Luminal B样型组，Her2过表达型组，基底细胞样型组中差异具有明显显著性(P<0.05)；BRCA1蛋白表达与年龄、肿瘤大小、肿瘤距乳头距离、组织学分级、腋窝淋巴结转移情况、ER/PR状态、Her2状态均无关(P均>0.1)；Ki67高指数表达率在Luminal A型组，Luminal B like型组，Luminal B样型组，Her2过表达型组，基底细胞样型组中差异具有明显显著性(P<0.05)；年龄组≤59岁的Ki67高指数表达率较年龄组≥60岁的增高，差异有统计学意义(P<0.1)；ER/PR阴性组和Her2阳性组的Ki67高指数表达率较ER/PR阳性组和Her2阴性组增高，差异具有统计学意义(P<0.1)；Ki67表达与肿瘤大小、肿瘤距乳头距离、组织学分级、腋窝淋巴结转移等临床病理指标无相关性(P均>0.1)；BRCA1与Ki67在各亚型乳腺癌中的表达呈负相关性(P<0.05)。结论 联合检测BRCA1和Ki67对不同分子分型乳腺癌有一定的预测预后价值。

乳腺肿瘤；不同分子分型乳腺浸润性导管癌；BRCA1；Ki67；免疫组织化学；FISH检测

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1582～1586)

乳腺癌是严重威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一。因其具有高度异质性，即使组织学类型、临床分期、治疗模式均相同，预后也存在着较大的差别。随着分子生物学理论和技术的发展，乳腺癌分子分型方法应运而生。由于其更加适应临床治疗及预后评估的需要，被越来越多的人所接受[1]。乳腺癌易感基因1(BRCA1)，是目前发现的与乳腺癌发生相关的最关键的抑癌基因。BRCA1表达发生异常者极有可能会引起细胞代谢和增殖的紊乱，甚至发生癌变。Ki-67 是由Gerdes 等[2]发现的1种与细胞有丝分裂周期密切相关的增殖细胞核抗原,可用来识别生长中正常细胞和肿瘤细胞,评估细胞的增生程度。BRCA1基因的突变携带情况与乳腺癌临床、预后关系虽已经基本明确[3]，但是由于目前国内技术的局限性，目前临床开展较多的还是通过免疫组化方法来检测BRCA1蛋白的表达情况，而BRCA1蛋白在癌组织中表达的临床意义和能否作为乳腺癌预后的因素还未能明确，并且BRCA1蛋白表达水平和Ki67的关系研究甚少。本次研究将应用免疫组织化学方法及荧光原位杂交技术(FISH)对乳腺浸润性导管癌病例进行分子分型，并通过免疫组织化学二步法检测BRCA1、Ki67蛋白在各分子分型乳腺癌中的表达情况，以探讨其在不同分子分型乳腺癌进展中的作用及临床意义，并研究BRCA1与Ki67之间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集江西省肿瘤医院2013年10月至2015年10月住院手术的、并经免疫组织化学检测(ER、PR、Her2、CK5/6、EGFR、Ki67等)和荧光原位杂交方法(FISH)检测从而明确分子分型的总共100例乳腺浸润性导管癌病例及其临床病理资料。乳腺癌各分子分型免疫组化抗体表达情况见表1，各分子分型组均随机选取20例，并采用免疫组织化学二步法检测以上收集病例的BRCA1蛋白的表达。选取的病例均为女性，年龄26～75岁，肿块大小1～10 cm。诊断、组织学分级、分期标准参考《2013版中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范》[4]：病理组织学分级Ⅰ级0例，Ⅱ级74例，Ⅲ级26例。患者术前均未行新辅助化疗和放射治疗。

表1 乳腺癌各分子分型免疫组化抗体表达情况

1.2 免疫组织化学染色

采用免疫组化二步法，严格按照操作说明书进行实验。BRCA1抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，其他相关指标抗体及实验试剂均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。ER、PR染色结果判定标准：细胞核内出现黄色或棕黄色颗粒且细胞数≥1%为阳性，相反则为阴性，ER、PR中任意一个为阳性则记为ER/PR阳性，若都为阴性则为ER/PR阴性；Her2染色结果判定：0：无任何着色；1+：任何比例的浸润性癌细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着色；2+：>10%的浸润性癌细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀的细胞膜呈棕黄着色或<30%的浸润性癌细胞呈强且完整的细胞膜棕褐色着色；3+：>30%的浸润性癌细胞呈现强且完整的细胞膜棕褐色着色。其中0和1+判定为Her2阴性，2+为不确定，3+为Her2阳性(Her2免疫组化检测2+或3+均需行FISH检测以明确其最终表达)；Ki67染色结果判定：胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，计数10个高倍视野肿瘤细胞中阳性细胞数，并计算阳性比率：<14%为低指数表达，≥14%为高指数表达；BRCA1染色结果判定标准：以肿瘤细胞胞质或胞核内出现棕黄色颗粒且数量>10%为阳性，≤10%为阴性。

1.3 荧光原位杂交技术(FISH)检测

FISH试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。对HER2免疫组化检测为(2+)或(3+)者再进行FISH检测，基因扩增表达者记为最终HER2阳性，不表达者记为Her2阴性。

1.4 统计处理

应用SPSS 17.0统计软件包进行实验数据的分析，BRCA1、Ki67表达与临床指标之间的关系分析采用校正的χ2Pearson检验，P<0.1为差异有显著性，P<0.05为差异具有明显显著性；BRCA1与Ki67间相关性分析采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 BRCA1、Ki67蛋白表达在不同分子分型乳腺癌中的阳性率

BRCA1蛋白阳性表达率在Luminal A型组，Luminal B like型组，Luminal B样型组，Her2过表达型组，基底细胞样型组中分别为95.0%(19/20)，85.0%(17/20),55.0%(11/20),80.0%(16/20)，75.0%(15/20)。结果显示BRCA1在Luminal A型组表达最高，其次是在Luminal B like型组、Her2过表达型组及基底细胞样型组，而在Luminal B样型组中表达最低。Luminal B样型乳腺癌中BRCA1阳性表达率明显低于其他四型乳腺癌(P<0.05)，见表2。

表2 BRCA1蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表达情况/例

Ki67高指数表达率在Luminal A型组，Luminal B like型组，Luminal B样型组，Her2过表达型组及基底细胞样型组分别为0(0/20)，85.0%(17/20)，100%(20/20)，75.0%(15/20)和85.0%(17/20)。结果显示：Ki67高指数表达率在Luminal B样型组最高，其次在Luminal B like型组、基底细胞样型组及Her2过表达型组，而在Luminal A型组中表达最低。Luminal A型乳腺癌中Ki67高指数表达率明显低于其它四型乳腺癌(P<0.05)，见表3。

2.2 BRCA1、Ki67表达与各亚型乳腺癌临床病理因素的关系

BRCA1蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤距乳头距离、组织学分级、腋窝淋巴结转移情况、ER/PR状态、Her2状态均无关(P均>0.1)。

表3 Ki67蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表达情况/例

Ki67高指数表达率在年龄<40岁组、年龄40～59岁组及年龄≥60岁组分别为61.1%(11/18)，75.8%(50/66)和50.0%(8/16),其在40～59岁年龄组中表达最高，其次为<40岁年龄组，而在≥60岁年龄组中表达最低，年龄组≤59岁的Ki67高指数表达率较年龄组≥60岁的增高，差异有统计学意义(P<0.1)；Ki67表达与肿瘤大小、肿瘤距乳头距离、组织学分级、腋窝淋巴结转移情况均无关(P>0.1)； ER/PR阴性组和Her2阳性组的Ki67高指数表达率较ER/PR阳性组和Her2阴性组增高，差异具有统计学意义(P<0.1)，见表4、表5。

表4 BRCA1表达与临床病理特征的关系/例

注：BRCA1为乳腺癌易感基因1；ER为雌激素受体；PR为孕激素受体；Her2为人表皮生长因子受体2。

表5 Ki67表达与临床病理特征的关系/例

注：BRCA1为乳腺癌易感基因1；ER为雌激素受体；PR为孕激素受体；Her2为人表皮生长因子受体2。

2.3 BRCA1与Ki67的关系

Spearman相关性分析得出，BRCA1与Ki67在各亚型乳腺癌中的表达呈负相关，γ=-0.199，P<0.05,见表6。

表6 BRCA1与Ki67表达在各亚型乳腺癌中的关系/例

3 讨论

近年来，随着基因表达谱和分子生物学深入研究，乳腺癌分子分型能反映肿瘤的生物学行为并能帮助判断预后和选择治疗方案[5],杨利利等[6]研究显示：Luminal A型乳腺癌复发和远处转移风险较低，预后较好；而Luminal B型相对Luminal A型侵袭性较高，预后较差。国外早有研究报告了原癌基因HER2的扩增，并指出HER2多拷贝性质可导致肿瘤复发和临床预后较差。目前多项研究证实HER2蛋白的过表达(HER2过表达型乳腺癌)是乳腺癌预后不良因素之一，Livasy等[7]研究表明基底细胞样乳腺癌具有较高的增殖指数和不良的临床预后。

在2011年St.Gallen国际乳腺癌的会议上，将最新乳腺癌分型标准提出来，Ki67作为区别激素受体型Luminal A型和Luminal B型的关键因素，阈值定为14%。Ki67与ER、PR、Her2等[8]指标一样被确定为判定乳腺癌临床预后转归的独立因素。从而Ki67指数大于14%反映了肿瘤细胞的增殖活跃高，恶性程度相对高，侵袭性较大并且预后相对差[9]，本次研究中，Ki67高指数表达率在Luminal B样型组最高，其次在Luminal B like型组、Her2过表达型组及基底细胞样型组，而在Luminal A型组表达率最低，其在Luminal A型组中的高表达率显著低于其他四种亚型(P<0.05)，表明相对于其他四种分子分型乳腺癌，Luminal A型乳腺癌其肿瘤细胞的增殖活跃低，恶性程度相对低，侵袭性较小并且预后相对好。这与杨利利等[6]研究结果相符。本次研究亦可见年龄组≤59岁的Ki67高指数表达率较年龄组≥60岁增高(P<0.1)； ER/PR阴性组和Her2阳性组的Ki67高指数表达率较ER/PR阳性组和Her2阴性组增高(P<0.1)，符合相关研究结果[10]。但Ki67表达与肿瘤大小、肿瘤距乳头距离、组织学分级、腋窝淋巴结转移情况均无关。

BRCA1是近年来发现的与乳腺癌发展有关的重要抑癌基因，其对细胞周期起着负调控作用。变异的BRCA1基因编码的蛋白功能缺失或降低致使细胞分化障碍，失去调控细胞增殖的作用进而导致细胞恶性转化引发肿瘤。有研究表明BRCA1的表达缺失或低表达与组织低分化和腋窝淋巴结转移有关[11]；汪菲等[12]研究表明，BRCAl的表达与雌二醇受体(ER)呈负相关，BRCAl的表达对乳腺癌细胞ER的表达有着抑制作用，因而降低细胞对雌激素的敏感度。而本次研究中，BRCA1蛋白表达与年龄、肿瘤大小、肿瘤距乳头距离、组织学分级、腋窝淋巴结转移情况、ER/PR状态、Her2状态均无关。这可能与入选病例的个体特异性有关，日后还需进一步扩大病例数量来探究BRCA1与以上临床病理资料之间的相互关系。有研究发现BRCA1阴性者的无瘤生存率明显低于阳性者，因此BRCA1基因突变和BRCA1蛋白表达下降均提示较差的预后。本次研究显示BRCA1与Ki67表达呈负相关(P<0.05)，表明BRCA1参与细胞周期的负调控，其表达减少可促进肿瘤细胞的增殖，因此，BRCA1基因突变和BRCA1蛋白表达下降均提示预后较差，但其具体机制还有待进一步研究证实。本次研究中，BRCA1阴性表达率在Luminal B样型组明显高于Her2过表达型组、Luminal B like型组、基底细胞样型组及Luminal A型组(P<0.05)，并且在Luminal A型组中所占比例最低。这与杨利利等[6]提及的Luminal A型乳腺癌复发和远处转移风险较低，预后较好而Luminal B型相对Luminal A型侵袭性较高，预后较差； Livasy等[7]研究出的基底细胞样乳腺癌具有较高的增殖指数和不良的临床预后等一系列研究结果相符。但由于本次入选研究的病例数量的限制，并未进一步发现BRCA1的表达在Luminal A型组、Luminal B like型组、Her2过表达型组以及基底细胞样型组之间的差别，而对于BRCA1表达在Luminal B型乳腺癌的两种亚型Luminal B样型和Luminal B like型之间出现差别的原因也有待进一步探究。因此，联合检测BRCA1和Ki67对不同分子分型乳腺癌有一定的预测预后价值，必要时可扩大样本量，进一步研究两者对乳腺癌分子分型关系的影响和相互作用。

综上所述，BRCA1蛋白表达缺失或减少，Ki67高指数表达均可作为判断乳腺癌预后不良的因素，由于其检测手段相对简单且费用低，检测结果简洁明了，两者联合检测可广泛应用于基层医院，从而为临床医师早期判断乳腺癌患者的临床预后提供重要线索。

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(编辑：吴小红)

Clinical Pathological Significance of BRCA1 and Ki67 Expression in Different Molecular Classification of Breast Cancer

ZHANGKe,MEIJinhong,CAIYong,etal.

JiangxiProvinceCancerHospital,Nanchang,330029

Objective To investigate the effect of BRCA1 and Ki67 in different molecular subtypes of breast cancer,and its clinical pathological significance.Methods Testing the tumor wax block by using FISH method which were Her2 2+ or 3+ detected by immunohistochemical method.FISH method showed the positive expression of tumor wax block was defined as Her2 positive expression,eventually.Classificating breast invasive ductal carcinoma in molecular classification according to the 2013 edition of the Chinese anti-cancer association guidelines and normative standard of diagnosis and treatment of breast cancer,and the breast cancer can be divided into 5 subtypes in molecular classification：Luminal A subtype group,Luminal B like subtype group,Luminal B subtype group,Her2 over-expression subtype group,basal-like subtype group.Select 15 cases from each subtype,total of 75 cases of breast invasive ductal carcinoma.Detected BRCA1 and Ki67 protein in each tumor tissues by immunohistochemical SP method and analyzed its relationship with the clinical pathological indicators.Results Positive expression rate of BRCA1 protein had obviously significant difference in the Luminal A subtype group,Luminal B like subtype group,Luminal B subtype group,Her2 over-expression subtype group and basal-like subtype group (P<0.05);There were no significant differences with the expression of BRCA1 protein and age,tumor size,tumor distance from the nipple,histological grade and axillary lymph node metastasis,ER/PR status as well as Her2 status(P>0.1);High index expression rate of Ki67 had obviously significant difference in the Luminal A subtype group,Luminal B like subtype group,Luminal B subtype group,Her2 over-expression subtype group and basal-like subtype group (P<0.05);High index expression rate of Ki67 in the ≤59 group was more than ≥60 group,the difference was statistically significant (P<0.1);High index expression rate of Ki67 in ER/PR negative group and Her2 positive group was more than that in ER/PR positive group and her2-negative group,the difference had statistical significance (P<0.1);There were

Breast neoplasms;Different molecular classification of breast invasive ductal carcinoma;BRCA1;Ki67;Immunohistochemistry;FISH detection

330029 江西省肿瘤医院(张 科,蔡 勇)；330000 南昌大学第一附属医院(梅金红，王立超)

王立超

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.005

R737.9

A

1001-5930(2016)10-1582-05

2016-07-20

2016-08-09)

no significant differences in the expression of Ki67 protein and tumor size,tumor distance from the nipple,histological grade as well as axillary lymph node metastasis(P>0.1);The expression of BRCA1 and Ki67 in different subtypes of breast cancer showed a negative correlation (P<0.05).Conclusion Joint detection of BRCA1 and Ki67 in different molecular classification of breast cancer might play an important role in predicting clinical outcomes.