脑脉利颗粒中丹参酮ⅡA姜黄素人参皂苷Rg1含量测定

苏梅，倪辉，秦引林，陈涛（江苏柯菲平医药股份有限公司，江苏南京210014）

脑脉利颗粒中丹参酮ⅡA姜黄素人参皂苷Rg1含量测定

苏梅，倪辉，秦引林，陈涛
（江苏柯菲平医药股份有限公司，江苏南京210014）

目的建立脑脉利颗粒中丹参酮ⅡA、姜黄素、人参皂苷Rg1含量的测定方法。方法采用甲醇提取，并采用高效液相色谱法进行脑脉利颗粒中丹参酮ⅡA、姜黄素、人参皂苷Rg1含量测定。结果脑脉利颗粒中丹参酮ⅡA的含量为2.25 mg/10 g，姜黄素的含量为0.47 mg/10 g，人参皂苷Rg1的含量为12.53 mg/10 g。结论高效液相色谱法简便、灵敏、准确，无干扰测定，可用于脑脉利颗粒制剂中丹参酮ⅡA、姜黄素、人参皂苷Rg1的含量测定。

色谱法，高压液相；丹参酮ⅡA；姜黄素；人参皂甙；脑脉利颗粒

脑脉利颗粒为纯中药制剂，源于“补阳还五汤”，加以药味增减，适用于中风急性期经络血瘀气虚证[1]。处方主要成分：益母草、三七、黄芪、川芎、姜黄、红花、丹参、赤芍、当归、白芍、川牛膝等11味中药，有效成分主要为盐酸水苏碱、益母草碱、人参皂苷Rg1、黄芪甲苷、芍药苷、姜黄素、丹参酮ⅡA等单体成分。本研究旨在针对脑脉利颗粒中的丹参酮ⅡA、姜黄素、人参皂苷Rg1这3种有效成分进行含量测定，对脑脉利颗粒在药理、临床等方面的深入研究，以及该品种的推广等具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料Agilent-1200高效液相色谱仪，Agilent OpenLAB CDS ChemStation色谱工作站。丹参酮ⅡA对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110766-200619）；姜黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110823-201004）；人参皂苷Rg1对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110703-201128）；乙腈（Merck公司，色谱纯）；甲醇、乙酸、磷酸、正丁醇、氨水为国产分析纯试剂；脑脉利颗粒（南京柯菲平盛辉制药有限公司，规格：每袋10 g，批号：11140301）；重蒸水（自制）。

1.2方法

1.2.1丹参酮ⅡA的含量测定[2-3]

1.2.1.1色谱条件色谱柱：岛津VP-ODS C18（150.0mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（60∶40）；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

1.2.1.2溶液的配制（1）对照品溶液的配制：精密称取丹参酮ⅡA对照品20 mg于容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密移取上述溶液1 mL置于10 mL容量瓶，甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.020 mg/mL丹参酮ⅡA的对照品溶液。（2）供试品溶液的配制：称取脑脉利颗粒适量，研钵研细，精密称取2 g，置50 mL锥形瓶，精密加入甲醇20 mL，称定质量，40℃下超声30 min，冷却至室温，再称定质量，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.1.3系统适应性试验精密吸取对照品溶液及供试品溶液，分别进样，记录色谱图。

1.2.1.4方法学考察（1）线性考察：精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇定量稀释，制成1.000 mg/mL的溶液；精密量取适量，定量稀释，分别制成每毫升中含5、10、20、40、80 μg的溶液。按照1.2.1.1项下色谱条件测定，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y（mV）为纵坐标绘制标准曲线。（2）精密度试验：按1.2.1.1项下色谱条件，取对照品溶液6份，进样，测定精密度，计算相对标准偏差（RSD）。（3）重复性试验：按1.2.1.1项下色谱条件，取供试品溶液共6份，进样，测定重复性，计算RSD。（4）回收率试验：取已知含量的供试品溶液6份，分别精密加入与样品中丹参酮ⅡA含量相当的丹参酮ⅡA对照品，按1.2.1.1项下色谱条件测定，计算回收率。

1.2.1.5含量测定分别取上述对照及供试品溶液各2份，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，外标法计算含量。

1.2.2姜黄素的含量测定[4-6]

1.2.2.1色谱条件色谱柱：岛津VP-ODS C18（150.0 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.5%冰乙酸溶液（45∶55）；检测波长：430 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

1.2.2.2溶液的配制（1）对照品溶液的配制：精密称取姜黄素对照品20 mg于容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密移取该溶液1 mL置50 mL容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，制成0.004 mg/mL姜黄素对照品溶液。（2）供试品溶液的配制：取脑脉利颗粒适量，研钵研细，精密称取2 g，置50 mL具塞锥形瓶，精密加入甲醇20 mL，称定质量，40℃下超声处理30 min，冷却至室温，称定质量，甲醇补足减失质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过。精密移取续滤液5 mL置于10 mL容量瓶，流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.2.3系统适应性试验精密吸取对照品溶液及供试品溶液，分别进样，记录色谱图。

1.2.2.4方法学考察（1）线性考察：精密称取姜黄素对照品适量，2%甲醇定量稀释，制成100 μg/mL的溶液；精密量取适量，分别定量稀释，配制成每毫升中含1、2、4、8、16 μg的溶液。按照1.2.2.1项下色谱条件测定，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y（mV）为纵坐标绘制标准曲线，计算姜黄素回归方程。（2）精密度试验：按1.2.2.1项下色谱条件，取对照品溶液共6份，进样，测定，根据峰面积计算姜黄素含量（n=6）计算RSD。（3）重复性试验：按1.2.2.1项下色谱条件，取供试品溶液共6份，进样，测定，计算RSD。（4）回收率试验：取已知含量的供试品6份，各精密加入与样品中姜黄素含量相当的姜黄素对照品，按照1.2.2.1项下的色谱条件测定，计算回收率。

1.2.2.5含量测定分别取上述对照品及供试品溶液各2份，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，外标法计算含量。

1.2.3人参皂苷Rg1含量测定[7-10]

1.2.3.1色谱条件色谱柱：InertSustain C18（150.0 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-pH2.0磷酸水缓冲溶液（19∶81）；检测波长：203 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

1.2.3.2溶液的配制（1）对照品溶液的配制：精密称取人参皂苷Rg1对照品20 mg于容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成含人参皂苷Rg1 0.200 mg/mL的对照品溶液。（2）供试品溶液的配制：称取脑脉利颗粒适量，研钵研细，精密称取5 g，置100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，40℃下超声处理30 min，冷却至室温，再称定质量，甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤。精密移取续滤液20 mL，蒸发皿浓缩蒸干，残渣加重蒸水30 mL溶解，转移至250 mL分液漏斗中，用水饱和正丁醇振摇提取4次（30、30、20、20 mL），合并正丁醇液，20 mL氨试液洗涤，蒸干正丁醇液。流动相溶解残渣并转移至10 mL容量瓶，流动相稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.3.3系统适应性试验精密吸取对照品溶液及供试品溶液，分别进样，记录色谱图。

1.2.3.4方法学考察（1）线性考察：精密称取人参皂苷Rg1对照品适量，流动相定量稀释制成每毫升中含1 mg的溶液；精密量取适量，分别定量稀释，配制成每毫升中含50、100、200、400、800 μg的溶液。按照1.2.3.1项下色谱条件测定，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y（mV）为纵坐标绘制标准曲线。计算人参皂苷Rg1回归方程。（2）精密度试验：按1.2.3.1项下色谱条件，取对照品溶液共6份，进样，测定（n=6），根据峰面积计算RSD。（3）重复性试验：按1.2.3.1项下色谱条件，取供试品溶液共6份，进样，测定，计算RSD。（4）回收率试验：取已知含量的供试品6份，分别精密加入与样品中人参皂苷Rg1含量相当的人参皂苷Rg1对照品，按1.2.3.1项下色谱条件测定，计算平均回收率。

1.2.3.5含量测定分别取上述对照品及供试品溶液，各2份，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，外标法计算含量。

2　结果

2.1丹参酮ⅡA测定结果

2.1.1系统适应性试验供试品在与对照品出峰相应的保留时间未出现杂质峰，此色谱条件下的分离度较好。结果表明，丹参酮ⅡA以外的其他成分对丹参酮ⅡA的测定无干扰。见图1、2。

图1　丹参酮ⅡA对照品高效液相色谱图

图2　丹参酮ⅡA供试品高效液相色谱图

2.1.2方法学考察

2.1.2.1线性关系线性回归方程为：Y=6 079.59X+ 30.50（r=0.999 7）。表明在0.1～1.6 μg时线性关系良好。

2.1.2.2精密度RSD为0.4%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.2.3重复性RSD为1.9%，表明方法重复性良好。

2.1.2.4回收率计算平均回收率为96.7%，RSD为3.6%。

2.1.3丹参酮ⅡA含量脑脉利颗粒中丹参酮ⅡA含量为2.25 mg/10 g。

2.2姜黄素测定结果

2.2.1系统适应性试验供试品在与对照品出峰相应的保留时间未出现杂质峰，该色谱条件下的分离度较好。表明样品中姜黄素以外的其他成分对姜黄素的测定无干扰。见图3、4。

图3　姜黄素对照品高效液相色图谱

图4　姜黄素供试品高效液相色谱图

2.2.2方法学考察

2.2.2.1线性关系线性回归方程为：Y=6 629.86X+ 140.60（r=0.999 6），表明姜黄素在0.02～0.32 μg时线性关系良好。

2.2.2.2精密度RSD为1.5%，表明仪器精密度良好。

2.2.2.3重复性RSD为1.4%，表明方法重复性良好。

2.2.2.4回收率平均回收率为96.7%，RSD为2.3%。

2.2.3样品中姜黄素含量脑脉利颗粒中姜黄素含量为0.47 mg/10 g。

2.3人参皂苷Rg1测定结果

2.3.1系统适应性试验供试品在与对照品出峰相应的保留时间未出现杂质峰，该色谱条件下的分离度较好。表明制剂中人参皂苷Rg1以外的其他成分对人参皂苷Rg1的测定无干扰。见图5、6。

图5　人参皂苷Rg1对照品高效液相色谱图

图6　人参皂苷Rg1供试品高效液相色谱图

2.3.2方法学考察

2.3.2.1线性关系线性回归方程为：Y=220.7X+18.8（r=0.999 8）。表明人参皂苷Rg1在1～16 μg时线性关系良好。

2.3.2.2精密度RSD为2.4%，表明仪器精密度良好。

2.3.2.3重复性RSD为2.3%，表明方法重复性良好。

2.3.2.4回收率平均回收率为97.8%，RSD为1.8%。

2.3.3样品中人参皂苷Rg1含量脑脉利颗粒制剂中人参皂苷Rg1含量为12.53 mg/10 g。

3　讨论

目前，国内有关脑脉利颗粒含量测定的相关报道不多，本研究采用了甲醇超声提取，高效液相色谱法测定了脑脉利颗粒中丹参酮ⅡA、姜黄素；采用甲醇超声，水饱和正丁醇萃取，高效液相色谱法测定了脑脉利颗粒中人参皂苷Rg1的含量。3个组分测定线性关系，r均在0.999以上。表明组分在浓度范围内线性关系良好。丹参酮ⅡA：回收率RSD为3.6%；姜黄素：回收率RSD为2.3%；人参皂苷Rg1：精密度RSD为2.4%，重复性RSD为2.3%，其他方法学考察RSD均控制在2.0%以下，表明方法系统适应性良好。制剂中组分含量测定准确度高，方便、快捷，能有效控制脑脉利颗粒制剂的质量。由于处方中君药为益母草，质量控制的主要指标为益母草中水苏碱，标准中用薄层扫描法进行定量，误差偏大；未来在制剂的标准提升中考虑用高效液相色谱法控制益母草中水苏碱的含量。

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[3]张长坡，张延博.RP-HPLC法测定消痤丸中隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量[J].中国现代药物应用，2015，9（17）：279-280.

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Determination of TanshinoneⅡA，curcumin and ginsenoside Rg1 contents in Naomaili Granules

Su Mei，Ni Hui，Qin Yinlin，Chen Tao
（Jiangsu Carephar Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nanjing，Jiangsu 210014，China）

Objective To establish a method for the determination of tanshinoneⅡA，curcumin and ginsenoside Rg1 contents in Naomaili Granules.Methods The methanol extraction was adopted and the HPLC method was used to detect the contents of tanshinoneⅡA，curcumin and ginsenoside Rg1 in Naomaili Granules.Results In Naomaili Granules，the tanshinoneⅡA content was 2.25 mg/10 g，the curcumin content was 0.47 mg/10 g and the Ginsenoside Rg1 was 12.53 mg/10 g.Conclusion

The HPLC method is simple，sensitive and accurate without interact interfering and can be used for the contents determination of tanshinoneⅡA，curcumin and ginsenoside Rg1 in Naomaili Granules.

Chromatography，highpressureliquid；Anshinone；Curcumin；Ginsenoside；Naomaili Granules

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.008

A

1009-5519（2016）21-3282-03

苏梅（1974-），博士研究生，主要从事新药开发工作。

（2016-03-30

2016-06-20）