缺氧-复氧肾小管上皮细胞损伤的信号传导机制

胡语航，王兴勇

(1.四川省妇幼保健院重症医学科,成都 610045；2.重庆医科大学附属儿童医院 400014)



论著·临床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.025

缺氧-复氧肾小管上皮细胞损伤的信号传导机制

胡语航1，王兴勇2△

(1.四川省妇幼保健院重症医学科,成都 610045；2.重庆医科大学附属儿童医院 400014)

[摘要] 目的 探讨肾小管上皮细胞在缺氧-复氧(H-R)损伤后的信号传导机制。方法 将不同方法处理的人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)分为对照组、模型组和PDTC组，模型组和PDTC组再分别分成缺氧6、12、24 h组、缺氧24 h后分别复氧6、12、24 h组；检测细胞成活率、NF-κB p65蛋白表达、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA及蛋白表达情况。结果 与对照组比较，模型组随缺氧时间延长细胞数量逐渐减少，24 h达高峰(P<0.05)，复氧后细胞数量略有增加；随缺氧时间延长NF-κB p65阳性蛋白表达增多，复氧6 h组达高峰(P<0.05)； ICAM-1 mRNA及蛋白表达随H-R时间延长渐增高(P<0.05)。PDTC组中NF-κB p65蛋白和ICAM-1 mRNA及蛋白表达较模型组有明显下降(P<0.05)。结论 H-R诱导HK-2细胞中NF-κB p65的活化，从而上调ICAM-1 mRNA及蛋白表达。

HK-2；缺氧/复氧；核因子-κB；细胞间黏附分子-1

[Abstract] Objective To investigate the signal transduction pathway mechanism of human renal tubular epithelial cell damage induced by hypoxia-reoxygenation.Methods Human renal tubular epithelial cell line HK-2 cell was used as target cell.The experiment are divided into the control group,the model group and PDTC group.Each group was further divided into 6 subgroups according to the times of hypoxia or/and reperfusion(H6、H12、H24、R6、R12 and R24).Detected the cell survival,the protein expression of nuclear factor-κB(NF-κB)protein65,the mRNA and protein expression of ICAM-1 respectively.Results Compare with control group,cell survial were significantly decreased and droped the lowest in group H24(P<0.05)which induced by Hypoxia.H/R up-regulates NF-κB protein65,and the mRNA and protein expression of ICAM-1 of the cell increased significantly(P<0.05).In addition,expression of NF-κB protein65 and ICAM-1 which induced by H-R were remarkably reduced in the PDTC group(P<0.05).Conclusion H/R induced NF-κB activation and increased ICAM-I mRNA and protein expression,this effect can be inhibit by PDTC.It suggested that H/R induces ICAM-l mRNA and protein expression in HK-2 cells through activation of NF-κB.

人体遭受各种打击包括创伤、窒息、严重感染后均容易导致缺氧缺血性肾损伤，缺氧后肾脏损伤的严重程度，是决定患者预后好坏的重要因素[1]。但目前尚不清楚，缺氧性肾损伤后促进肾小管上皮细胞活化表达细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的途径和机制。因此，本实验探讨缺氧-复氧(hypoxia-reoxygenation，H-R)诱导的人肾小管上皮细胞损伤机制并且检测其ICAM-1表达情况，为治疗肾缺血再灌注损伤提供新的临床思路和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)购自中国典型培养物保藏中心。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC，NF-κB p65的特异性抑制剂)购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HK-2细胞常规种植于培养基(含10%胎牛血清的DMEM/F12)中。每周传1～2代。处理前用无血清DMEM/F12培养基培养24 h，使细胞转G0期。

1.2.2 H-R损伤模型的建立 按下列分组进行处理，对照组：置培养板于正常孵箱中培养；缺氧组：置培养板于充有95% N2、5% CO2混合气体的密闭容器后再一起放入正常孵箱内，分别缺氧6、12、24 h；复氧组：各组均于缺氧24 h后取出，分别放入正常孵箱中继续培养6、12、24 h；PDTC组：每孔中加入PDTC(终浓度为50 μmol/L)后各组再进行相应H-R处理。倒置相差显微镜下观察HK-2细胞形态。

1.2.3 检测NF-κB p65的表达 细胞爬片采用4 ℃的丙酮进行制作，并采用免疫组织化学检测NF-κB。用Image-Pro Plus 6.0软件对其平均光密度比值进行细致的统计与分析。

1.2.4 ICAM-1 mRNA表达的检测 提取各组细胞总RNA，通过逆转录方式生成cDNA，再以适量cDNA为模板，PCR扩增在TaqDNA聚合酶催化下进行。其扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，并进行光密度扫描获得光密度(OD)值。本实验参照文献[2]进行引物设计。

1.2.5 ICAM-1蛋白的测定 采用ELISA法，各孔分别加入各组细胞培养上清液100 μL，在酶标仪波长450 nm处测定OD值。

1.2.6 细胞增殖的测定 采用MTT法，将HK-2细胞接种于培养板中，同时给予相应H-R处理，测定各标本在波长490 nm处OD值。

2 结 果

2.1 H-R后HK-2细胞形态学改变 各模型组细胞数量明显减少，并且随缺氧时间的延长，出现明显的下降趋势，表现为培养基中细胞贴壁性差，折光性下降，悬浮细胞数量明显增加。尤其以缺氧24 h组上述改变达高峰；复氧后细胞数量较缺氧虽有所增加，但较对照组折光性减弱，细胞状态欠佳。对照组中，细胞呈扁平梭状，形态良好，贴壁和折光性较好。

2.2 细胞增殖 随着缺氧时间的延长，模型组与对照组比较在各时间点活细胞数量明显减少，缺氧24组达最低值，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。PDTC组与其对应时间点H-R组(缺氧6、12、24 h组，复氧6、12、24 h组)比较，有明显的保护作用，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同H-R处理组对HK-2细胞成活率的影响

a:P<0.05，与同时间点对照组比较；b:P<0.05，与同时间点模型组比较。

2.3 H-R诱导的HK-2细胞中NF-κB p65的表达 对照组仅见NF-κB p65在细胞质中呈弱阳性及少量表达。各模型组HK-2细胞的细胞质及细胞核中的NF-κB p65均有明显的阳性表达，而以复氧6 h组最为明显。复氧12、24 h组NF-κB p65阳性表达较复氧6 h组下降。NF-κB p65的表达在PDTC组与其对应H-R组(缺氧6、12、24 h组，复氧6、12、24 h组)比较明显减少(P<0.05)，见表2。

表2 不同H-R处理组HK-2细胞NF-κBp65阳性表达情况

a:P<0.05，与同时间点对照组比较；b:P<0.05，与同时间点模型组比较。

2.4 H-R诱导HK-2细胞ICAM-1 mRNA及蛋白表达 对照组HK-2细胞表达ICAM-1 mRNA的量极低。与对照组比较，经H-R诱导后各模型组ICAM-1 mRNA及蛋白表达量明显上调，自缺氧12 h组开始差异有统计学意义(P<0.05)，复氧24 h组扩增条带亮度及宽度达高峰，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而PDTC组ICAM-1 mRNA及蛋白表达量明显减少，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。表3、4。

表3 不同H-R处理组HK-2细胞ICAM-1 mRNA表达情况

a:P<0.05，与同时间点对照组比较；b:P<0.05与同时间点模型组比较。

表4 不同H-R处理组HK-2细胞ICAM-1蛋白表达情况

a:P<0.05，与同时间点对照组比较；b:P<0.05，与同时间点模型组比较。

3 讨 论

急性缺血性肾损伤的病理发生过程主要包括小管上皮细胞损害、白细胞聚集活化及血液动力学改变等方面。本实验通过对H-R处理的肾小管上皮细胞的细胞形态学观察发现，随着缺氧时间的延长，细胞贴壁率及折光性逐渐减少，并且细胞数量逐渐减少，这与肾缺血性损伤的组织学改变是一致的。本实验显示缺血24 h组上述改变最为明显。

NF-κB是一种多效可诱导的核转录因子，可以调控任何含有κB位点的基因转录[1]，缺氧导致肾小管上皮细胞损伤的机制尚不明确，可能[2-4]是通过激活细胞内NF-κB活性并表达，调控NF-κB信号传导通路中的下游因子，包括ICAM-1、白细胞介素1、16、18、肿瘤坏死因子等多种炎性因子、细胞因子的表达，加重炎性反应。本试验结果证实了这一观点：在H-R诱导后HK-2细胞NF-κB p65活性随缺氧时间延长而逐渐增强，并于复氧6 h达高峰。给β其特异性抑制剂PDTC阻断NF-κB治化后，各组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。本实验证实缺氧可作为始动因素激活NF-κB在HK-2细胞中的表达，且在缺氧6 h达高峰。

缺氧刺激后，靶器官细胞ICAM-1产生增加，表达明显，致使中性粒细胞游走、吞噬和浸润，导致强烈的免疫炎性反应[1-3,4-7]。已有学者证实[8]ICAM-1的激活及过度表达参与了急性缺血性肾损伤的病理生理过程，并通过介导白细胞与内皮细胞的黏附,导致靶器官的内皮细胞充血、水肿和局部的微循环障碍，最终导致内皮损伤[9]。免疫炎性反应的刺激激活了细胞内的ICAM-1、单核白细胞和巨噬细胞导致组织细胞的损伤[10-13]，损伤的组织细胞进一步激活靶细胞导致炎症因子包括ICAM-1，肿瘤坏死因子，白细胞介素等“瀑布样”释放增多，形成恶性循环，加重已经损伤的内皮细胞。

缺氧作为始动因素，NF-κB被活化、ICAM-1表达增多、ICAM-1介导中性白细胞黏附，三者互相促进，互为因果，导致靶细胞损伤[14]。本研究证实H-R损伤诱导HK-2细胞的ICAM-1的激活和表达呈时间依赖性，即随着时间的延长，细胞损伤加重，ICAM-1的激活和表达增加。与对照组比较，采用PDTC处理后，H-R处理的HK-2细胞ICAM-1 mRNA表达无改变。因此，H-R性肾损伤机制可能是由于H-R诱导的HK-2细胞内NF-κB活性升高，促进肾小管上皮细胞的ICAM-1 mRNA转录及蛋白表达上调，进一步促进炎症因子释放而加重肾小管内皮细胞的损伤。

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Progression on signal transduction pathway mechanism of HK-2 cells injury induced by hypoxia-reoxygenation

HuYuhang1,WangXingyong2△

(1.SichuanProvincialHospitalforWomenandChildren，ICU，Chengdu610045,China；2.Children′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China)

HK-2；Hypoxia-reoxygenation； Nuclear factor-κB； ICAM-1

胡语航(1982-)，主治医师，硕士，主要从事多器官功能障碍基础与临床研究。△

R459.7

A

1671-8348(2016)28-3962-03

2016-06-16

2016-07-28)