亚慢性暴露壬基酚诱发大鼠非酒精性脂肪肝的研究

杨雪松，俞 捷,杨雪峰，罗 娅，杨 静,李克彬,许 洁△

(1.遵义医学院公共卫生学院 563000；2.遵义医学院附属医院胃肠外科，遵义 563099)



·论 著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.004

亚慢性暴露壬基酚诱发大鼠非酒精性脂肪肝的研究

杨雪松1，俞 捷1,杨雪峰2，罗 娅1，杨 静1,李克彬1,许 洁1△

(1.遵义医学院公共卫生学院 563000；2.遵义医学院附属医院胃肠外科，遵义 563099)

[摘 要] 目的 探讨连续90 d灌胃壬基酚(NP)能否诱发非酒精性脂肪肝(NAFLD)。方法 48只雄性SD大鼠分成4组，即对照组，低、中、高剂量组，NP剂量分别为0、20、60、180 mg·kg-1·d-1,每组平均分为常规饮食、高脂饮食两个亚组。空腹灌胃NP 90 d，期间每周称量1次体质量，第60天行肝脏彩超观察。第90天全自动生化分析仪检测肝功、血脂，高效液相色谱仪检测肝脏中NP的浓度。结果 各剂量常规饮食组与对照组比较，低、中、高剂量组三酰甘油(TG)降低(P>0.05)，天门冬酸氨基转移酶(AST)升高(P<0.05)，低、高剂量组丙氨酸氨基转移酶(ALT)降低(P<0.05)，低密度脂蛋白(LDL)减低(P<0.05)，对照组及低、中剂量组未出现脂肪肝，高剂量组1/2的动物出现脂肪肝。各剂量高脂饮食组与对照比较，低、中、高剂量组、TG升高(P<0.05)，ALT降低(P<0.05)，AST升高(P<0.05)，HDL升高(P<0.05)，高剂量组总胆固醇(TC)升高(P<0.05)，高脂饮食组被选部分动物中，低、中剂量组1/2的动物出现了脂肪肝，高剂量组则全部出现脂肪肝病变。与对照组比较，低、中、高剂量组大鼠肝脏NP浓度升高(P<0.05)，肝脏NP浓度与染毒剂量的存在秩相关rs常规饮食=0.942,rs高脂饮食=0.481(P<0.05)。结论 亚慢性染暴露NP是导致NAFLD的危险因素之一，增加了NAFLD的发病风险。

壬基酚；非酒精性脂肪肝；常规饮食；高脂高糖饮食

[Abstract] Objective To explore whether expose to nonyphenol(NP)can induce non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)in rats,subchronically.Methods Totally 48 male SD rats were randomly divided into 4 groups,namely,control,low,middle,and high dose group,the doses were 0,20,60,180 mg·kg-1·d-1,each group was divided into normal diet and night fat diet equally.The rats were intragastric administration of NP 90 d,weights of rats were examined once a week,on the 60th day ,livers were detected by colored type-B ultrasonic.On the 90th day,liver function and blood fat were tested by automatic biochemistry analyzer,content of liver's nonyphenol examed by high performance liquid chromatograph.Results In normal diet,compare with control group,low,middle and high dose group of glycerol triglyceride(TG) was decreased(P<0.05),aspartate amino shift enzyme(AST) increased in middle and high groups(P<0.05),alanine transfer enzyme(ALT)decreased(F=12.973,P<0.05)in low and high group,low density lipoprotein(LDL)decreased(P<0.05).In normal diet,there was no occurrence of NAFLD in control,low and middle groups,but a half of animals were suffered from NAFLD.In the high fat diet,compared with control group,ALT was decreased in low,middle and high dose(P<0.05),AST was rose(P<0.05)and TG was increased(F=2.979,P<0.05);in high dose group,the total cholesterol(TC) was increased(P<0.05),in low dose group and middle dose group,HDL was increased(P<0.05).In some selected animals of the high fat diet group,half of the animals in the low and middle dose groups occurred NAFLD,while in high dose group all occurred NAFLD.Compared with the control group,concentration of NP in rat liver were increased in treatment gounp(P<0.05),NP concentration and the exposure dose exit rank correlation coefficient(rsnormal diet=0.942,rshigh dose=0.481;P<0.05).Conclusion Exposure to NP is one of the risk factors which leading to NAFLD,subchronically,which increases the risk of NAFLD.

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其他明确的肝损害因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为主要特征的临床病理综合征[1]。目前发病逐年上升，一般人群发病率为10.3%[2],肥胖人群发病率达到75.0%，而且随生活方式的改变还在上升[3],肥胖程度越高，患NAFLD的可能性越大[4]，NAFLD的患病在发达国家超过30%而且仍然在持续上升[5]。据估计，当前有大约10亿人患有不同形式的脂肪肝[6]，目前研究报道NAFLD的发病原因，除了与肥胖，2型糖尿病，胰岛素抵抗，药物所致的肝损伤有关[7]，环境因素也越来越受到重视。壬基酚(nonylphenol,NP)是一种环境内分泌干扰物(EEDs)，它是烷基酚聚氧乙烯醚的最终降解产物，被广泛用于润滑油添加剂、树脂、塑化剂、表面活化剂、涂料、化妆品和其他配方产品的制备[8]。目前我国每年的NP产量是50 000吨，由于大量应用，在非职业暴露人群脂肪组织或血清中均检测出NP[9]。近年来众多流行病学和动物实验研究表明，EEDs暴露与不断增加的NAFLD发病率有关,还一些流行病数据暗示EEDs与人类健康的有害结局相关[10]。但是揭示EEDs对人类健康潜在影响的流行病资料非常少，因此，需要更多深入的人群调查[11-13]。人类主要通过饮水和食物暴露NP，但是目前关于NP暴露能否诱发NAFLD未见报道。本研究首次通过连续90 d灌胃染毒观察NP对NAFLD发生是否具有作用。为进一步研究NAFLD发病机制提供初步指导。

1 材料与方法

1.1 动物和分组 48只SPF级雄性SD大鼠购于第三军医大学大坪动物中心，合格证号为SCXK(渝)2012-0005,分为对照组、低、中、高剂量组(0,20,60,180 mg·kg-1·d-1)。常规饮食亚组(C、L、M、H)喂养普通饲料(100%基础饲料)，高脂饮食亚组(CH、LH、MH、HH)给予高脂高糖饲料(15%猪油，20%白糖，65%基础饲料)。NP溶于玉米油中，每天清晨7:00～9:00点空腹灌胃90 d，每次灌胃1 h内完成。即对照组只灌玉米油，其余3组灌含NP的油溶剂，灌胃体积为10 mL/kg-1·d-1。试验动物饲养于空调(格力)控温的动物房，维持环境温度(20±2)℃、相对湿度为(60±5)%。按8 g/100 g体质量给予干饲料，自由饮水，黑暗/光照每12小时交替1次。

1.2 主要试剂与仪器 纯度99%NP(日本东京化成株试会社集团有限责任公司)，玉米油(山东鲁花集团有限责任公司)，全自动分化分析仪(贝克库尔曼特)，低速离心机(Eppendorf公司),多普勒彩色B超(Phlips)，高效液相色谱仪(Aligent 1100,USA)。

1.3 方法 (1)体质量、B超：染毒期间每周称量1次体质量，注意体质量变化。第60天每个亚组取2只大鼠行肝脏彩超，判断有无脂肪肝形成。(2)肝体指数(肝质量/体质量×100%)、脂体指数(脂质量/体质量×100%)：剖杀动物前称量体质量用以计算肝体指数、脂体指数。取血后，完整取下肝脏，肉眼观察，生理盐水浸洗血液，滤纸吸干表面水分，称湿质量，计算肝体指数。取睾丸、附睾旁脂肪，称质量，计算脂体指数。(3)肝功、血脂：第90天7%水合氯醛麻醉(0.5～0.8 mL每100 g体质量)大鼠。所有血样2 h内4 000 r/min离心10 min后取上清液上机检测，全自动生化分析仪按使用指南操作。(4)高效液相色谱法测肝脏中NP,取0.5 g组织置于具塞玻璃管中，加入正己烷-乙醚混合物(V正∶V乙=7∶3)4 mL,手持匀浆机20 000 r/min匀浆5～10 s，4 000 r/min离心10 min，取上清液到另一洁净玻璃管中，50 ℃水浴蒸干，加入0.5 mL乙腈溶解过滤后全部移至上样瓶上机检测。色谱条件：色谱柱(ECLIPSE XD8-C18、150 mm×460 mm、5 μm,Agilent,USA)，流动相(乙腈与0.1%冰乙酸混合物，体积比=85∶15)，柱温40 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL,激发波长275 nm,发射波长312 nm。FLD检测器。

1.4 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行数据分析，对多组计量资料做方差分析，差异有统计学意义后再用SNK法进行两两比较。两非正态变量做Spearman相关，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组体质量变化趋势 每组大鼠平均体质量呈先上升再减低然后持续上升最后下降的总趋势(图1)。以12次称量的平均体质量表示，常规饮食组中，随染毒剂量增加体质量减轻(P<0.05)。高脂饮食中，LH、MH、HH组与CH组比较，体质量略下降,仅LH组与CH组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 高剂量组体质量动态变化

2.2 肝质量、肝体指数及脂肪质量、脂体指数比较 第90天大鼠开腹后肉眼观察肝脏，常规饲料组肝脏边缘薄，赤褐色，与C组比较无明显肉眼可见区别，M组与C组比较肝体指数有差异(P<0.05)，H组与C组比较脂体指数差异有统计学意义(P<0.05)。高脂饲料组，相同染毒剂量肝脏体积普遍比常规饲料组大，包膜紧张，边缘钝，切面触之有油腻感，散在点状或小片状淡黄色区域布于肝脏表面，但是LH、MH、HH组与CH组比较无肉眼可见差别,肝体指数差异无统计学意义(P>0.05)、脂体指数差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两种饮食肝体指数、脂体指数±s,%)

2.3 肝脏中NP浓度 常规饲料组和高脂饲料组，与各自对照组比较，低、中、高剂量组大鼠肝脏NP浓度升高(P<0.05)，肝脏NP浓度与染毒剂量秩相关系数rs普=0.942,rs高=0.481(P<0.05)，见表2。

表2 不同饮食肝脏NP浓度

2.4 肝脏彩超 肝脏大小以肝斜径表示，普通饲料组各自组和高膙脂饮食组各自组组间未出现明显差异，但相同剂量高脂组大于常规饲料组。整个肝区回声均匀，无强回声区。即普通饲料组无B超所见脂肪肝变性，高脂饮食组肝脏出现强回声结节，提示有脂肪肝形成,见图2。

A：普通饮食组；B：高脂饮食组。

图2 高脂饮食与普通饮食肝脏超声比较

2.5 肝功和血脂 常规饮食组中各NP剂量组与C组比较，丙氨酸氨基转移酶(ALT)降低，M、H组天门冬酸氨基转移酶(AST)升高，总胆固醇(TC)升高。低密度脂蛋白(LDL)降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3；对照组，低、中剂量组未出现脂肪肝，高剂量组1/2的动物出现脂肪肝。高脂高糖饮食组，ALT随染毒剂量上升逐渐下降；与CH组、ALT降低比较，AST升高，LDL升高，HH组TC升高，见表4；高脂饮食组被选部分动物中，低、中剂量组1/2的动物出现了脂肪肝，高剂量组则全部出现脂肪肝病变。

表3 常规饮食组各亚组肝功、血脂数值±s)

表4 高脂饮食组各亚组饮食肝功、血脂数值±s)

3 讨 论

NP是一种代表性的EEDs，具有拟雌激素作用，能够竞争性与体内部分雌激素受体结合，从而影响体内正常的激素代谢[14]，其中胰岛素抵抗可能与此有关。本实验为模拟人摄入NP的方式，采取灌胃法对实验动物染毒，考虑人群中男性NAFLD患病率较高[2]，前期主要研究NP的拟雌激素样作用干扰男性体内激素平衡从而影响机体健康，故全部选择雄性大鼠进行实验。目前NAFLD的发病机制尚不完全明了，大多数学者普遍接受的是“二次打击”学说。即：第1次打击主要是胰岛素抵抗，引起良性的肝细胞内脂质沉积；第2次打击主要是氧化应激和脂质过氧化，此为疾病进展的关键。氧化应激状态是指活性氧(ROS)及其代谢产物的产生超过机体的防御和去毒能力，使促氧化物和抗氧化物之间的动态平衡失调。此外，肥胖、2型糖尿病、高脂血症单独或共同成为NAFLD的易感因素[1]，本实验中各组大鼠体质量的均数变化成先增加再减低然后持续上升最后减低的总趋势。大鼠第1次体质量上升为适应性喂养阶段的正常体质量上升，此期体质量上升较快，说明饲养境及气象条件适宜，大鼠适应能力较强，此环境可以满足试验动物的饲养要求。自第2周起，体质量开始迅速短暂下降，是灌胃引起的不适导致进食量迅速下降引起的。在这阶段后1周，试验大鼠体质量开始长时间持续上升，且增长平稳，增长曲线斜率比适应性喂养略低。说明动物对灌胃刺激适应期已过，并且逐渐适应灌胃，和灌胃者熟悉程度增加也有关系。但是为何斜率会低于第1周，是因为体质量增长速度低于适应性喂养阶段，可能的是毒效应已经开始对体质量产生影响。最后阶段，体质量持续缓慢下降，在8周时体重开始下降说明，此期可能是大鼠机体与毒物在进行一个相互斗争的过程，说明毒物已对大鼠造成严重不可逆损害，机体不能适应和完全清除毒物，超过其耐受程度，由毒物蓄积转变为功能蓄积。肝脏中NP浓度随染毒剂量的上升而升高，表明肝脏是NP的贮存库之一，这与范奇元等[15]的研究一致，且说明肝脏不能对20 mg·kg-1·d-1染毒进行消除，此剂量能对动物造成不可逆性的损伤。这与文献报道的NP的无可见有害怕作用水平(NOAEL)为10 mg·kg-1·d-1一致。肝内NP检测结果显示，两对照组肝内也有少量NP检出，这可能是饲料和饮水中含有微量的NP所致，笔者将在以后进一步的实验中进行改进。此外，作者发现，除中剂量组外，高脂饮食组肝脏内NP浓度高于相同染毒常规饮食组。这与高脂饮食组出现脂肪肝，NP具有较高的脂溶性有关。肝脏B超显示普通饲料组未见回声增强区域，表明大鼠无明显的脂肪肝变性改变，说明高剂量(180 mg·kg-1·d-1)诱发了NAFLD。高脂饮食组几乎都出现了严重的脂肪肝病变，且LH、MH组1/2被检动物出现了脂肪肝，HH组则全部出现了脂肪肝。说明高脂高糖饮食诱导脂肪肝是可取的方法，NP可以升高实验动物患NAFLD的比例。后期笔者们将从肝脏的炎症反应、细胞凋亡、脂质代谢通路去探索NP诱发NAFLD的发病机制，为该病的预防提供指导。一般情况下，NAFLD会致ALT升高，但本次研究中，ALT呈下降趋势，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，较为反常。这种现象是因为肝脏损害严重的“胆酶分离”现象造成还是有其他原因需要进一步研究证实。然而AST却是上升的，与对照组比较差异同样有统计学意义(P<0.05)。AST主要存在与细胞核中，这说明毒物对肝细胞的损伤已经累及到细胞核，肝脏细胞损害严重。另外，较对照组，LDL呈下降趋势，说明NP染毒影响了LDL的合成或分泌。间接地导致TG运出肝脏减少，使得TG较多沉积于肝脏，为脂肪肝的形成提供了先决条件。

综上所述，高脂高糖饮食诱导脂肪肝模型成功率高。亚慢性暴露NP是NAFLD的发病危险因素，对NAFLD的发生、发展有作用。

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Study of non-alcoholic fatty liver disease in rats induced by nonylphenol subchronic exposure*

YangXuesong1,YuJie1,YangXuefeng2,LuoYa1,YangJing1,LiKebin1,XuJie1△

(1.SchoolofPublicHealth,ZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou563000,China；2.DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou563099，China)

nonylphenol；non-alcoholic fatty liver；normal diet;high fat diet

国家自然科学基金资助项目(201360439，81560527)；贵州省教育厅青年基金资助项目(黔教合KY字[2013]198)；贵州省卫生厅基金资助项目(gzwkj20131127)；遵义医学院招标基金资助项目(2013F-68)；贵州省科技厅基金资助项目(黔科合LH字[2014]7543，黔科合J字[2014]2177号，[2014]2185号)；遵义医学院研究生社会实践基金资助项目(ysh-2015-001)。作者简介：杨雪松(1989-)，在读硕士,主要从事环境毒理学研究。△

R114

A

1671-8348(2016)28-3900-04

2016-06-18

2016-07-06)