HPLC法测定蓝狐胆汁酸成分与含量

黄金野 张晶钰 柴龙会 刘菁菁 肖向红

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

HPLC法测定蓝狐胆汁酸成分与含量

黄金野 张晶钰 柴龙会 刘菁菁 肖向红*

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

修回日期：2016-02-18

发表日期：2016-05-10

高效液相色谱；

目前国内毛皮动物养殖规模逐年壮大，其中貂(Martesspp.)、狐(Vulpesspp.)、貉(Nyctereutesspp.)3大毛皮动物的养殖数量更居世界首位，历史最高年份3种毛皮动物养殖总量逾5 000万只，占世界毛皮动物养殖总量的50%[1]。数量如此巨大的毛皮动物在冬季取皮后，其胴体、内脏、骨骼能得到有效利用，但大量的胆囊胆汁被丢弃浪费，特别是胆汁中的胆汁酸。胆汁酸具有诸多的生理功能，可以促进脂肪和脂溶性物质的消化吸收[2]，或作为一种激素参与胆固醇的代谢，使动物体内胆固醇的代谢处于一种动态平衡。胆汁酸不仅具有保肝利胆，维护动物机体健康的作用，还具有镇咳、平喘、消炎、抗过敏以及抑菌等作用[3]。此外有研究表明胆汁酸与肿瘤的发生发展密切相关[4]，迄今为止国内外对动物胆汁的分离研究较多[5-10]，唯独缺少对狐胆汁的相关研究，本实验室前期研究结果显示狐胆囊胆汁对离体蟾蜍(Bufosp.)心脏具有正性作用，并对狐胆汁进行初步分离[11-12]。本实验以蓝狐(北极狐，Vulpeslagopus)胆囊胆汁为实验材料，利用高效液相色谱技术测定其胆汁酸成分与含量，为狐胆囊胆汁酸的研究与有效利用提供科学依据。

高效液相色谱法是现今化学学科中最具有优势的分离分析方法之一。与其他分离分析方法相比高效液相色谱法具有良好的稳定性。对相同样品的分离效果基本保持不变，具有极好的稳定性，多次重复可以获得重现性良好的实验结果。在食品、制药、环境监测、生物工程、生物化学和精细化工等许多领域都作为重要技术在使用。在生物制品的分离分析领域，尤其是在复杂成分的动物胆汁的分离分析领域具有权威性和通用性。

1 仪器与试剂

Waters600E高效液相色谱仪；Waters SunFireTMC185μm色谱柱(尺寸4.6 mm×150 mm)；Waters 2487双通道紫外检测器；天津奥特赛斯仪器有限公司超声波清洗机、溶剂过滤器；梅特勒-托利多仪器有限公司电子分析天平、pH计；北京四环科学仪器厂冷冻干燥机；Milli-Q超纯水仪；J.T.Baker甲醇(色谱级)；天津市科密欧化学试剂有限公司KH2PO4、K2HPO4、H3PO4；北京百灵威科技有限公司胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)；Sigma-Aldrich公司去氧胆酸(DCA)、牛磺胆酸钠盐水合物(TCANa·nH2O)、牛磺去氧胆酸钠盐水合物(TDCANa·nH2O)；中国药品生物制品检定所牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 标准品溶液制备

精密称取少量标准品于进样瓶中，用1 mL甲醇充分溶解后备用。制得标准品溶液浓度分别为胆酸(CA)12.1 g/L、去氧胆酸(DCA)12.7 g/L、鹅去氧胆酸(CDCA)15.4 g/L、熊去氧胆酸(UDCA)10.8 g/L、牛磺胆酸(TCA)3.4 g/L、牛磺去氧胆酸(TDCA)2.3 g/L、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)1.4 g/L、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)2.5 g/L。

2.1.2样品溶液制备

新鲜蓝狐胆囊胆汁(采自黑龙江农业实验基地狐貉饲养场)在-20℃下冷冻72 h后置于冷冻干燥机中制成冻干粉[13]，每100 g蓝狐胆囊胆汁可得狐胆粉(2.74±0.63)g，获取率为3.37%～2.11%。精密称取冻干粉350 mg，溶于50 mL甲醇中，超声波溶解10 min(功率300 W，频率25 kHz)，经0.45 μm脂溶性微孔滤膜滤过，取滤液置于50 mL容量瓶中，加入甲醇并稀释至刻度线。作为待测样品溶液备用。

2.2 色谱条件

色谱柱为WatersC18，流动相为甲醇和KH2PO4溶液，KH2PO4溶液浓度为0.25～0.35 mol/L(pH=3～4)，采用流速1.1 mL/min，等度洗脱，检测波长为205 nm。色谱图见图1。

各色谱峰保留时间见表1。

表1保留时间

Tab.1 Retention time

2.3 方法学考察

2.3.1 线性

分别精密称取标准品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL、35 μL、40 μL进样分析，测定峰面积值。按照以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并得到回归方程(表2)。结果显示在所示范围内线性关系良好。

图1 蓝狐胆囊胆汁样品Fig.1 Blue Fox bile samples

表2 线性关系

Tab.2 Linear relationship

2.3.2 精密度

分别取标准品溶液10 μL在最优色谱条件下重复5次进样分析。对测定的标准品的色谱峰保留时间和面积数据进行精密度分析(表3)，结果RSD值(相对标准偏差)均小于2%说明精密度良好。

2.3.3 重复性

依照2.1.2样品溶液制备方法，将5份蓝狐胆汁样品制成样品溶液，在最优色谱条件下分别进样10 μL分析测定，数据分析结果见表4。

表3 精密度试验结果

Tab.3 Results of precision test

表4 重复性实验结果

Tab.4 Results of repeated experiments

依据重复性实验表对8个色谱峰分别计算RSD值均小于2%，结果表明样品的重复性良好。

2.3.4 稳定性

取样品溶液分别在0、1、3、5、7、9、12、24 h进样测定，数据分析结果见表5。

表5 稳定性实验结果

Tab.5 Results of stability test

所得色谱图中峰面积的RSD值均小于2%，结果表明各峰的稳定性良好。

2.4 成分与含量测定

由图1、表1～表3可知蓝狐胆汁中含有牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)和牛磺去氧胆酸(TDCA)见图2，利用峰面积数据与胆粉获取率进行定量分析，可知上述胆汁酸分别约占蓝狐胆囊胆汁质量的0.010 1%、0.171 8%、0.039 6%和0.079 9%。

图2 蓝狐胆囊胆汁样品与标准品(1.牛磺去氧胆酸标品，2.牛磺鹅去氧胆酸标品，3.牛磺胆酸标品，4.牛磺熊去氧胆酸标品，5.狐胆汁样品)Fig.2 Chromatogram of blue fox bile samples and chromatogram of standard samples (1.TDCA，2.TCDCA，3.TCA，4.TUDCA，5.Blue fox bile)

3 讨论

液相色谱技术中样品的分离效果与流动相、色谱柱柱温、流动相pH、流速等因素有关。在优化流动相组成时，先后用甲醇、乙腈、纯水以及磷酸盐溶液中的一种或几种溶液筛选流动相，其中以甲醇-磷酸盐溶液体系的分离效果最佳。实验过程中发现增加流动相中的甲醇比例可提高分离效率，但会影响分离效果。当甲醇比例降低至20%甚至以下时，可将本实验图1中1、2号峰进一步分离。实验过程中调整磷酸盐浓度可以影响色谱峰的峰型，当浓度为0.25～0.35 mol/L时峰型较好。流动相pH也是本实验中影响样品分离效果的一个重要因素，研究发现当用磷酸调节磷酸盐溶液的pH范围在3～4时分离效果良好，综上所述，本试验确定色谱条件为：色谱柱Waters C18，流动相甲醇和KH2PO4溶液，KH2PO4溶液浓度0.25～0.35 mol/L(pH=3～4)，等度洗脱，流速1.1 mL/min，检测波长205 nm。用此色谱条件分离蓝狐胆囊胆汁获得4种胆汁酸分别为：牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)和牛磺去氧胆酸(TDCA)。利用该方法分离蓝狐胆囊胆汁酸效果良好，具有操作简便、重复性好等优点，此方法可为狐胆囊胆汁质量标准制定提供参考。

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HPLC(High-performance liquid chromatography)；Fox bile；Bile acid；Content

HPLCDeterminationofBlueFoxBileAcidCompositionandContent

HuangJinyeZhangJingyuChaiLonghuiLiuJingjingXiaoXianghong*

(NortheastForestryUniversity，Harbin，150040，China)

We developed a method to assess the bile acid composition and content of blue fox(Vulpeslagopus)by high-performance liquid chromatography(HPLC)with ultra-violet(HPLC-UV).We used Waters C18and the mobile phase was methanol and KH2PO4，concentration of KH2PO4solution was 0.25-0.35 mol/L(pH=3-4)，isocratic elution.The flow rate was 1.1 mL/min and the detection wavelength was 205 nm.Blue fox bile contained TUDCA，TCA，TCDCA and TDCA，accounting for 0.0101%，0.1718%，0.0396% and 0.0799% of blue fox gallbladder bile quality，respectively.Each component of blue fox bile showed good linear relation.This analytical method proved reliable，accurate，and repeatable，and it can be used to assay the bile acid composition and content of blue fox.These results are important for the development and utilization of blue fox bile.

稿件运行过程

2016-01-11

狐胆汁；

胆汁酸；

含量测定

S865.2+3

A

2310-1490(2016)02-108-05

建立测定蓝狐(Vulpeslagopus)胆汁酸成分与含量的高效液相色谱方法。其方法为：采用HPLC-UV法，色谱柱为Waters C18，流动相为甲醇和KH2PO4溶液，KH2PO4溶液浓度为0.25～0.35 mol/L(pH=3～4)，等度洗脱，流速为1.1 mL/min，检测波长为205 nm。结果：蓝狐胆囊胆汁中含牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)和牛磺去氧胆酸(TDCA)，分别约占蓝狐胆汁质量的0.010 1%,0.171 8%,0.039 6%和0.079 9%。结论：胆汁酸各组分的线性关系良好，本方法准确可靠，重复性好，可用于测定蓝狐胆汁酸成分及含量，对合理开发和利用蓝狐胆汁资源具有积极意义。

黄金野，男，26岁，硕士研究生；主要从事生理学研究。

*通讯作者：肖向红，E-mail：xiaoxh2010@sina.com