低温胁迫下东北林蛙GLUT1转录表达水平的动态变化

郭柏宏肖向红巩珊珊张晶钰柴龙会

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

低温胁迫下东北林蛙GLUT1转录表达水平的动态变化

郭柏宏 肖向红巩珊珊 张晶钰 柴龙会

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

葡萄糖转运体1；

东北林蛙(Ranadybowskii)主要分布在我国东北部，季节性的低温环境使东北林蛙具有高效的抗冻策略，形成高浓度的葡萄糖保护剂是重要的抗冻机制之一。GLUT1是机体细胞中分布最广泛葡萄糖转运蛋白。本实验采用高通量测序技术获得东北林蛙GLUT1 mRNA片段，通过实时荧光定量PCR技术分析低温胁迫下(-1℃)东北林蛙随胁迫时间延长，其肝脏、骨骼肌、心脏、脂肪、皮肤组织中GLUT1转录水平的表达变化。结果发现，肝脏和心脏的GLUT1在低温胁迫24 h达到峰值，分别为对照组的9.17倍和5倍；脂肪体和骨骼肌的GLUT1转录水平于48 h达到峰值，为对照组的7.2倍；GLUT1在皮肤中没有显著变化。结果表明，GLUT1参与东北林蛙低温胁迫下的应激反应，并在形成细胞高浓度葡萄糖方面发挥着重要作用。

东北林蛙(Ranadybowskii)主要分布于我国东北部、朝鲜、日本及俄罗斯等地。由于此地处亚寒带，冬季气候寒冷干燥，年平均温度达到0℃以下，作为两栖类变温动物，东北林蛙越冬时要面临严峻的低温威胁和生存压力，因此在环境温度过低时会通过冬眠降低机体代谢水平，维持生命[1-2]。其中，体内形成高浓度的葡萄糖作为抗冻保护剂是机体重要的抗冻保护机制之一，它在减少细胞水分流失，降低冰晶形成，防止细胞塌陷，稳定细胞膜和膜内大分子起到重要作用[3-6]。

葡萄糖转运体1(glucose transporter protein 1，GLUT1)，是哺乳动物中转运葡萄糖跨膜运输重要的载体蛋白，糖转运体蛋白家族(GLUTs)是促进己糖跨膜运输的一系列蛋白，GLUTs家族中共有14名成员GLUT(1-14)，每一个成员都分别对不同的己糖有特异性的亲和能力、特异性的组织分布、亚细胞定位以及生理功能。GLUT1是一种膜蛋白，在哺乳动物中基本结构由 12个跨膜片段组成，可以顺浓度差将细胞外的葡萄糖运送至细胞内部[7]。GLUT1是目前已知分布最广的GLUT家族的葡萄糖转运体，在各个组织器官都有不同程度的表达。在人体中主要表达于红细胞，血脑屏障，表皮细胞等[8]。

目前GLUT1的研究主要是见于哺乳动物和人的肿瘤及糖尿病方面[9]，对于两栖类低温环境下葡萄糖作为机体抗冻保护剂的相关机制研究还很少。本实验通过对低温胁迫下GLUT1基因表达水平分析为两栖类抗冻保护剂的形成提供证据，同时也为GLUT1的功能性研究提供新的视角。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

东北林蛙，健康成年雄性36只，采集于黑龙江省铁力林场，体重(22±2)g。其中实验组18只，对照组18只。饲养在通气良好的容器中，容器中加入适量活性碳处理的水，以不没过蛙身高度为准。将蛙放置于4℃环境中适应2周，同时设实验对照组。

1.2 低温模型的建立

将在4℃的东北林蛙置于-1℃温控冰箱驯养45 min后，开始计时低温胁迫。分别于4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h组织样本采集，每个时间点分别随机取样3只。采用双毁髓法迅速取其肝脏、心脏、骨骼肌、皮肤和脂肪体样本，-80℃保存备用。

1.3 总RNA的提取和cDNA的合成

将组织用去酶的剪刀剪碎，加入TRIzol®Reagent(ambion，USA)1 000mL，匀浆，具体步骤按照TRIzol®Reagent说明书操作。总RNA浓度与完整性通过分光光度计和2%琼脂糖凝胶电泳检测。总RNA-80℃保存备用。cDNA的合成用ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO，Japan)反转录试剂盒完成，具体操作以说明书为准，cDNA保存于-20℃。

1.4 实时荧光定量PCR

1.4.1 引物设计

东北林蛙GLUT1序列片段由高通量测序获得(由华大基因测序分析)，东北林蛙GLUT1引物由Beacon Designer 7软件完成(表1)。通过RT-PCR和标准曲线选择适合的引物。按照2x Taq Master Mix(TIANGEN，Beijing)说明书进行PCR反应，模版为反转录实验合成的cDNA。PCR条件：94℃ 2 min变性；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，共30个循环扩增；72℃ 5 min 延伸。得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2 标准曲线的绘制

将得到清晰的单一且片段大小正确的条带进行qPCR标准曲线的绘制。qPCR仪器及分析选用CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，Hercules，CA)。以反转录实验获得的cDNA为模版，进行梯度稀释，按10倍稀释成4个梯度。相关酶试剂采用2x SuperReal Premix Plus(TIANGEN，Beijing)荧光定量试剂盒，实验操作以说明书为准。实验条件采用两步法，95℃ 15 min 变性；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环，退火和延伸。在每次的延伸后进行荧光检测，将收集到的数据作为Cq值，进行标准曲线的绘制，保证E=85%～105%，R2>0.980。选取符合条件的引物进行实时荧光定量PCR实验，具体步骤如荧光定量试剂盒说明书所示，内参基因选用GAPDH。其中每个qPCR反应孔做3次重复，每个时间点做3次独立样本重复。

1.4.3 数据处理及分析

将实时荧光定量PCR数据通过Livak(2-ΔΔCq)方法对实验组和对照组进行处理。最终的数据分析通过SPSS19.0软件，置信区间设为0.05，实验数据用均值±标准差(图2)。SPSS 19.0 分析软件进行单因素方差分析，通过t检验，P<0.05 为差异显著。

2 结果

2.1 GLUT1引物的选择及标准曲线的建立

通过引物筛选，内参基因GAPHD和GLUT1的引物PCR结果及绘制标准曲线，溶解曲线结果如下(表1，图1)。

表1荧光定量PCR引物GAPDH和GLUT1

Tab.1 The primers of GAPDH and GLUT1 for qPCR

2.2 低温胁迫下东北林蛙中GLUT1mRNA表达水平的变化

在低温-1℃胁迫下，肝脏的GLUT1mRNA表达水平逐渐升高，胁迫24 h后显著升高为对照组的9.17倍(P<0.01)，48 h后其表达水平逐渐降低。心脏的GLUT1mRNA表达水平上调，12～24 h表达量达高峰，为对照组的5倍(P<0.05)，48 h后开始降低，72 h降低为对照组的0.5倍。脂肪体的GLUT1mRNA表达水平在最初胁迫的24 h无显著变化，48 h则显著升高，为对照组的7.2倍，72 h降至初始水平。骨骼肌的GLUT1 mRNA表达水平在4～8 h逐渐升高为对照组的4.3倍，12～24 h降低为对照组的2倍，48 h后GLUT1 mRNA表达水平又上调达峰值，为对照组的7.9倍(P<0.01)，72 h恢复为初始表达水平的2.3倍。皮肤的GLUT1mRNA总体呈上调表达趋势，为对照组的2～3倍，仅8 h降低至对照组水平的0.4倍。

图1 GLUT1在qPCR中的溶解曲线Fig.1 The melt curve of GLUT1by qPCR

图2 低温胁迫下东北林蛙不同组织GLUT1mRNA表达变化内参基因为GAPDH(* P<0.05，** P<0.01)Fig.2 The expression of GLUT1 mRNA during cold exposure in Rana dybowskii The corresponding tissues were liver，heart，fat body and skin. GAPDH as the reference (* P<0.05，** P<0.01)

3 讨论

两栖类耐寒机制的研究始于上世纪八十年代[10]，Joanisse在研究Ranasyivatica中发现在低温环境下两栖动物通过精确的代谢调节避免细胞外液结冰。目前耐寒性动物有两种主要的抗冻机制，一种是机体转换为低代谢状态，通过抑制某些生化过程，降低能量损耗，从而保护机体免受低温损伤[11]；另一种通过体内合成高浓度的抗冻保护剂，最常见的为甘油和葡萄糖[12]。Storey研究发现在低温胁迫下美洲树蛙主要器官的葡萄糖含量增加到150～300 mM，为机体初始水平的30～50倍[6，13]。

GLUT1是一种特异性转运葡萄糖的载体蛋白，分布广泛，为细胞转运葡萄糖，提供细胞代谢所需的能量。因此我们推测，GLUT1的上调表达是细胞内形成高浓度的葡萄糖保护剂的重要机制。本实验发现，肝脏、心脏、骨骼肌、脂肪体和皮肤中的GLUT1在低温胁迫下的mRNA表达水平呈上调趋势。其中，在低温胁迫初期(4～12 h)上调表达最显著的是皮肤组织，表明皮肤作为机体外部重要的防御和保护组织，对温度的变化最为敏感。GLUT1基因水平的上调表达，预示着皮肤是最早合成抗冻保护剂的组织，为保护机体避免细胞结冰，起到了重要的门户作用。随后在8 h中表达变化最显著的是骨骼肌组织，由此可见骨骼肌也是在低温胁迫早期形成抗冻保护剂的重要组织。低温胁迫中期(24～48 h)，GLUT1mRNA表达上调的组织为内脏器官，其中包括肝脏、心脏和脂肪体，其表达水平达到峰值的时间相对滞后(24～48 h)，其中变化最显著的为肝脏组织。分析肝脏作为机体转运葡萄糖的重要代谢器官，肝脏对葡萄糖的大量转运不仅可以形成高浓度的抗冻保护剂，保护机体阻止细胞内冰晶形成，免受低温损伤，同时也可以为相关抗冻蛋白的合成提供能源，保证机体在低温应激下的能量所需。在低温胁迫后期(72 h)，组织中上调GLUT1mRNA表达水平都有所回降，可见在机体逐渐适应低温环境下降低了葡萄糖的转运水平，以维持细胞内环境的稳态。

综上所述，通过对低温胁迫下东北林蛙不同组织中GLUT1mRNA表达水平变化的分析，表明GLUT1参与了低温胁迫的应激反应，低温冬眠期为组织器官高效率转运葡萄糖，在形成细胞内高浓度的葡萄糖抗冻保护剂和能量供应方面起重要作用。

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Glucose transporter 1(GLUT1)；Cryoprotectant；Cold exposure；Glucose

TheDynamicofGLUT1mRNAExpressioninRanadybowskiiDuringColdStress

GuoBaihongXiaoXianghong*GongShanshanZhangJingyuChaiLonghui

(NortheastForestryUniversity，Harbin，150040，China)

Dybowski’s frog(Ranadybowskii)is found in northeast China where it faces a seasonally cold climate.Thus the frog has evolved effective self-protection strategies for surviving cold during winter.One of these mechanisms is high concentration of glucose in blood which serves as a cryoprotectant.GLUT1 is the most widely distributed in the body cells.In this study，we obtained partial GLUT1 mRNA fragments by high-throughput sequencing and analyzed the changes in level ofRanadybowskiiGLUT1 mRNA transcript in liver，heart，fat body，skeletal muscle and skin during cold stress at-1℃ by using quantitative real-time PCR.In liver and heart，GLUT1 mRNA levels reached their peaks after 24h of cold stress at 9.17 and 5 fold induction to their control groups，respectively.In skeletal muscle and fat body，the expression of GLUT1 reached its top levels of 7. 2 fold induction after 48h of cold exposure． GLUT1 expression showed no significant change in skin． This study showed that GLUT1 participated in cold stress responses of Rana dybowskii and played an essential role in maintaining high concentrations of glucose．

稿件运行过程

2016-01-18

修回日期：2016-02-03

发表日期：2016-05-10

抗冻保护剂；

冷刺激；

葡萄糖

S858.94

A

2310-1490(2016)02-134-04

郭柏宏，女，27岁，硕士研究生；主要从事分子生物学实验研究。

*通讯作者：肖向红， E-mail：xiaoxh2010@sina.com