驯鹿产气荚膜梭菌的分离鉴定

韩一啸 周 伟 贾 敏 祝令伟 纪 雪孙 洋 刘 军 王海军 郭学军*

(1.吉林农业大学动物科技学院，长春，130118；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春，130122；3.吉林省野生动物救护繁育中心，长春，130122)

驯鹿产气荚膜梭菌的分离鉴定

韩一啸1，2周 伟2贾 敏2祝令伟2纪 雪2孙 洋2刘 军2王海军3郭学军2*

(1.吉林农业大学动物科技学院，长春，130118；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春，130122；3.吉林省野生动物救护繁育中心，长春，130122)

修回日期：2016-03-14

发表日期：2016-05-10

驯鹿；

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)又称魏氏梭菌，是一种革兰氏阳性产芽孢杆菌，广泛分布在土壤、污水、饲料、食物和粪便等环境样本中，能引起多种动物坏死性肠炎、肠毒血症及人类食物中毒和创伤性气性坏疽，是一种重要的人兽共患病原菌[1]。魏氏梭菌能产生多种外毒素，根据其产生的主要毒素(α、β、ε、ι)可将菌株分为A、B、C、D和E等5种毒素型[2]。该菌在全球范围内流行，能感染牛、羊、猪、家兔等多种家养动物，也有野生动物如大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)、鹿(Cervidae)、狮(Pantheraleo)、牦牛(Bosgrunniens)等感染产气荚膜梭菌的报道，其中以A型毒素型流行最广[3-4]。目前在临床上尚无有效的治疗方法，发病迅猛，一旦发病，多数来不及治疗均以死亡告终。

驯鹿(Rangifertarandus)主要分布于北半球的环北极地区，包括在欧亚大陆和北美洲北部及一些大型岛屿。在中国驯鹿只见于大兴安岭东北部林区。驯鹿不仅具有很高药用和食用价值，而且具有一定的旅游和文化价值。驯鹿非常温顺，是唯一可以用于使役的鹿科动物，鄂温克族就会使用驯鹿作为交通工具[5]。驯鹿已被列入中国国家林业局2000年8月1日发布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》中。

2015年5月，本实验室从猝死驯鹿的肝、脾、肾、血的样本中分离获得一株产气荚膜梭菌，进行了毒素型鉴定，为野生动物疾病防控提供了参考病例数据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

无菌采集猝死驯鹿的血、肾、肝和脾编号为1号、2号、3号、4号，低温保存送回实验室，制作触片革兰氏染色镜检。

1.2 病原鉴定

1.2.1 培养特性鉴定

依据国家标准GB 4789.13-2012《食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》，厌氧培养的情况下在胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂平板上生长黑色菌落，接种到液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)可观察到大量产气的现象，初步判定为产气荚膜梭菌。

分别取血、肾、肝和脾样本分别划线接种含5%兔血琼脂平板、TSC琼脂平板和FTG液体培养基，37℃厌氧培养12 h，观察细菌生长状态。

1.2.2 分子生物学鉴定

挑取TSC琼脂平板上生长的黑色菌落接种FTG液体培养基进行纯培养，取1 mL纯培养液离心收集菌体，经灭菌生理盐水洗涤2遍后，用200 μL灭菌蒸馏水重悬，水浴煮沸10 min作为PCR模板。由长春库美生物公司合成细菌16S rRNA通用引物[6]，产气荚膜梭菌α毒素、β毒素、ε毒素、ι毒素、肠毒素、β2毒素特异性引物[7]，进行PCR扩增并测序比对分析，血清型PCR结果可根据表1进行判定[8]。

表1产气荚膜梭菌毒素型

Tab.1 Toxin types of Clostridium perfringens

1.3 药敏试验

取新鲜液体纯培养物0.1 mL均匀涂布TSC琼脂培养基上，正面放置待菌液完全吸收后，无菌夹取头孢吡肟、头孢匹罗、头孢曲松、吡利霉素、头孢他啶、氨曲南、左氧氟沙星、四环素、阿莫西林、环丙沙星、阿米卡星、氨苄青霉素、复方磺胺甲噁唑药敏试纸片(购自宝泰克)置于培养基上压实，37℃厌氧培养24 h，量取抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 病情报告

某动物园雄性驯鹿，4岁，身体状况良好，2014年9月引进。白天园区内散养，夜晚补饲青草、花生壳、苔藓、玉米面、豆饼、胡萝卜和苹果。在2015年4月22晚未正常回圈，23日7：00发现已死亡。尸体表观特点为腹胀、肛门四周污秽、鼻孔有血性黏液。剖检皮下出血、肠管破裂、腹腔有大量肠内容物、大肠段肠壁薄、脾脏肿大、肝脏土黄色、心包积血、肺充血。

2.2 镜检观察

对血、肾、肝和脾制作的触片进行革兰氏染色镜检。均可见革兰氏阳性、菌体两端钝圆、呈粗杆状、单个、成双或者成短链状存在，个别菌体有芽孢(图1)，芽孢不大于菌体宽度，为单极芽孢，革兰氏染色不能着色。

图1 本试验中样本革兰氏染色Fig.1 Sample gram staining in this experiment

2.3 病原分离与鉴定

2.3.1 TSC琼脂平板黑色菌落观察

依据国家标准GB 4789.13-2012《食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》，产气荚膜梭菌在厌氧培养条件下在胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂平板上生长黑色菌落，可初步判定为产气荚膜梭菌。该菌仅在厌氧条件下生长为专性厌氧菌，将血、肾、肝和脾样本分别划线接种于TSC琼脂培养基上，37℃厌氧培养12 h，均可见到有大量表面光滑、正圆形、球状突起的黑色菌落生长(图2)。

图2 在TSC琼脂平板上长出的黑色菌落Fig.2 The black colony on TSC agar

2.3.2 FTG液体培养产气情况观察

在TSC琼脂平板上挑取黑色单菌落接种于FTG液体，培养约12 h，可见细菌生长并伴有轻微产气现象。

2.3.3 血琼脂平板实验

将分离菌株划线接种于5%兔鲜血琼脂平板厌氧培养12 h后，形成灰白色的圆整、表面湿润、黏稠、隆起的菌落，大小约1.5～2.0 mm，菌落周围呈双环溶血(图3)。

图3 血琼脂平板实验Fig.3 The test od blood agar plate

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 细菌16S rRNA

细菌16S rRNA基因产物由长春库美生物公司测序，获得1 357 bp目的片段序列，经NCBI Blast同源性比对，与产气荚膜梭菌ATCC 13124的同源性为100%。基于16S rRNA序列，采用MEGA 6.0(Neighbor-Joining)构建系统进化树如图4。XL-1与产气荚膜梭菌标准菌株ATCC13124亲缘关系最近，与蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)ATCC11778、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC6633遗传距离较远。

图4 基于16S rRNA构建系统进化树Fig.4 The phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence

2.4.2 血清型PCR鉴定

PCR检测结果如图5所示：阳性对照为ATCC 13124 B型产气荚膜梭菌的标准菌株，PCR检测血液和各脏器仅有α目的条带，表明本次分离菌株携带α毒素基因，为A型产气荚膜梭菌。

图5 PCR检测结果M：DL2 000；0：阳性对照1-4：分别为血、肾、肝、脾分离的菌株Fig.5 PCR test resultsM：DL2 000；0：Positive control；1-4：The isolated strains were isolated from blood, kidney, liver and spleen.

2.5 药敏试验

参照美国NCCLS标准，比较抑菌圈直径结果表明，分离菌株对头孢替坦、吡利霉素、头孢他啶、氨曲南敏感，对头孢吡肟、阿米匹罗、头孢曲松、左氧氟沙星中度敏感，对四环素、阿莫西林、环丙沙星、阿米卡星、氨苄青霉素、复方磺胺甲噁唑耐药(表2)。

表2 分离菌对14种抗生素的敏感性实验

Tab.2 Fourteen antibiotic sensitivity test

注：根据1994年12月版美国NCCLS药敏试验纸片扩散法法规判定:“S”敏感 “I”中介 “R”耐药

3 讨论

产气荚膜梭菌在繁殖过程中会产生多种毒素蛋白，现已发现12种毒素，根据产生的毒素不同，可将其分为A型、B型、C型、D型、E型5个血清型。其中A型产气荚膜梭菌的致病因子是其产生的α毒素，α毒素可通过破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，从而使A型产气荚膜梭菌具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性[9]。

产气荚膜梭菌是一种条件性致病菌，其发病原因与菌株特性和环境因素密切相关。该菌株在自然界中分布广泛，形成芽孢以后对自然环境的抵抗能力较强，可长期存在于土壤中，当畜舍环境卫生条件较差时，动物采食了被产气荚膜梭菌污染的饲草或饮用水后，可引发此病[10]。正常情况下，在动物的肠道中存在一定数量的魏氏梭菌，肠道内容物的酸碱度和氧饱和度等内环境因素的变化会影响魏氏梭菌的繁殖。而肠道内环境的变化易受食物成分、动物年龄、动物营养状况、饲养环境温度突变的影响，如动物过量采食高蛋白和高能量的食物，采食粗纤维饲料少，导致消化不良，都可为肠道内魏氏梭菌增殖和毒素生成提供营养介质[11]。该病暴发时危害严重，发病急，病程短，动物常未见症状即突然死亡[12]。感染魏氏梭菌的家畜临床症状并不明显，死亡后的尸体外观出现腹胀明显、肛门扩张有少量粘液渗出，眼结膜红等特征，主要的剖检变化为心脏心肌纤维肿胀，有充血、坏死灶；肝脏坏死有色素颗粒沉着；脾脏肿大局部有出血及坏死；肾脏充血，坏死较严重；肠道十二指肠肌层薄，局部有凝固性坏死，大量散在的炎性细胞，绒毛层脱落，有出血、充血[13]。

本起疫情中的驯鹿死亡突然，根据尸体外观变化和剖检病变观察，我们怀疑是由魏氏梭菌感染引起，为进一步确诊，进行了病原分离培养及鉴定试验。从各脏器样本中分离到有相同形态特征的菌落，后经培养特性、菌落形态及分子生物学特性观察，最终判定导致驯鹿死亡的病原为A型产气荚膜梭菌，这与高文伟等[14]研究报道的引起鹿科动物死亡的病原菌主要为A型产气荚膜梭菌的结果一致。驯鹿发病在昼夜温差相对较大的4月，再加上驯鹿采食过量易导致其肠道内魏氏梭菌大量繁殖，这可能是致其猝死的主要原因。

产气荚膜梭菌病死亡症状与一些化学物质中毒有很多相似之处，容易被诊断为化学物质中毒[15]。另外，该病的突然死亡特征与炭疽也有相似之处，所以必须要进行细菌学、毒物学检查来进行确诊。由于存在细菌耐药性问题，通过药敏实验筛选合适的药物治疗，是十分必要的。此次分离出的菌株对头孢替坦、吡利霉素、氨曲南等药物敏感，这与艾地云等[16]和寇叙等[17]的分离菌株药敏结果存在着差异，在每次疫情防控中，需要针对流行菌株检测其药物敏感性，选用合适的药物来进行治疗。此次病情发生在驯鹿身上，虽然国内对从野生大动物中分离出产气荚膜梭菌的情况有少量报道，但就我们所知，这是首次报道产气荚膜梭菌致死驯鹿的病例，这表明产气荚膜梭菌不仅能引起家畜发病死亡，也能引起野生动物发病死亡。有关部门应予以重视并采取必要的预防措施，希望本次检测结果对今后驯鹿产气荚膜梭菌感染研究提供有力参考。

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Reindeer；Clostridiumperfringens；Pathogen isolation and identification

IsolationandIdentificationofClostridiumperfringensfromaReindeer

HanYixiao1，2ZhouWei2JiaMin2ZhuLingwei2JiXue2SunYang2LiuJun2WangHaijun3GuoXuejun2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun，130118，China；2.InstituteofMilitaryVeterinary，AMMS，KeylaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl，Changchun，130122，China；3.JilinWildAnimalConservationandBreedingCenter，Changchun，130122，China)

A farmed reindeer died suddenly.According to its body appearance and autopsy lesions，we suspected that the reindeer was infected byClostridumperfringens.In order to further confirmed the causes，the liver，spleen，kidney and blood samples from the dead reindeer were collected.AClostridiumperfringenstype A strain was recovered.The strain(XL-1)was then evaluated by cultural characteristics，colony morphology，molecular biology.Drug sensitivity tests showed that XL-1 was sensitive to cefotetan，ceftazidime and aztreonam.

稿件运行过程

2016-01-05

产气荚膜梭菌；

病原分离鉴定

S858.9

A

2310-1490(2016)02-113-05

某动物园驯鹿死亡突然，根据其尸体外观变化和剖检病变观察，怀疑为产气荚膜梭菌感染，为进一步确诊，进行了病原分离培养及鉴定试验。在猝死驯鹿的肝、脾、肾、血等样本中分离获得1株革兰氏阳性杆菌(编号XL-1)。经细菌培养特性鉴定、菌落形态观察、分子生物学鉴定，确定分离菌为A型产气荚膜梭菌。药敏实验显示，XL-1对头孢替坦、头孢他啶、氨曲南等药物敏感。

国家“863”项目(2012AA022006)；军队医药卫生课题(13CXZ024)

韩一啸，男，26岁，硕士研究生；主要从事分子细菌学的研究工作。E-mail：15144218386@163.com

*通讯作者：郭学军，E-mail：xuejung@yahoo.com