三虫半夏白术天麻汤对偏头痛大鼠脑组织5-HT1B/1D受体表达影响的实验研究*

陈少玫韦启志奚胜艳李世勇

（1.福建中医药大学附属厦门市中医院，福建 厦门 361009；2.厦门大学，福建 厦门 361000）

三虫半夏白术天麻汤对偏头痛大鼠脑组织5-HT1B/1D受体表达影响的实验研究*

陈少玫1△韦启志1奚胜艳2李世勇1

（1.福建中医药大学附属厦门市中医院，福建 厦门 361009；2.厦门大学，福建 厦门 361000）

目的 探索三虫半夏白术天麻汤治疗偏头痛的作用机制。方法 建立硝酸甘油致大鼠偏头痛模型，给予半夏白术天麻汤高、中、低剂量灌胃干预7 d，以苯甲酸利扎曲普坦为西药阳性对照药物，并予空白组、模型组进行对照。运用RT-PCR检测5羟色胺1B、1D（5-HT1B/1D）受体的基因表达。结果 1）对5-HT1B受体表达的影响:与空白组相比，模型组显著低于空白组（P＜0.01）；中药低剂量组与空白组无显著差异（P＞0.05），中药中剂量组、中药高剂量组、西药组及联合用药组显著低于空白组（P＜0.01）；中药低、中、高剂量组、西药组及联合用药组较模型组升高，但不具有显著差异（P＞0.05）。2）对5-HT1D受体表达的影响:与空白组相比，中药中剂量组显著降低（P＜0.05），其余各组，与空白组相比较无显著差异（P＞0.05）；与模型组相比，各组无显著差异（P＞0.05）；与中药中剂量组相比，空白组、中药低剂量组、西药组、联合用药组较中药中剂量组显著升高（P＜0.05），中药高剂量组与中药中剂量组相比无明显差异（P＞0.05）。结论 5-HT1B/1D受体调节异常为偏头痛的发病环节之一。三虫半夏白术天麻汤可以提高偏头痛大鼠脑组织5-HT1B受体的基因表达，对5-HT1D受体的基因表达具有双向调节作用，临床运用，剂量不宜过大。

5-HT1B/1D受体激动剂 利扎曲普坦 偏头痛 中医药 三虫半夏白术天麻汤

偏头痛是一种常见的神经血管功能紊乱性疾病，临床以反复发作的一侧或双侧搏动性头痛为特征。发作时伴有自主神经功能紊乱，面色苍白、心率加快、恶心、呕吐、畏光等；间歇期一切如常人。本病反复发作，发病机制尚不完全清楚，可能与遗传、内分泌、血管、神经递质、免疫等因素相关。2010年中国原发性头痛流行病学调查显示，偏头痛发病率为9.3%，治疗费用高达873.6亿元/年［1-2］。三虫半夏白术天麻汤［3-5］为陈少玫教授所创制的临床验方，运用此方治疗原发性头痛可获得较好效果［6-7］。本实验拟通过硝酸甘油致大鼠偏头痛模型，探讨该方对大鼠脑组织5羟色胺1B（5-HT1B）、5羟色胺1D（5-HT1D）受体表达的影响，为本方的临床运用提供科学依据。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 实验动物 清洁雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量（180～220）g，由上海新莱克实验动物有限责任公司生产，生产许可证号:SCXK（沪）2012-0002。实验动物质量合格证:2015000505392。使用许可证号:SYXK（闽）2013-0006。

1．2 实验药物 三虫半夏白术天麻汤（由全蝎3 g，蜈蚣10 g，僵蚕10 g，法半夏10 g，天麻10 g，钩藤15 g，川芎15 g，生蒲黄10 g，炒白术10 g，茯苓20 g，白芍30 g，甘草6 g组成），所用药材为全成分颗粒，由厦门市中医院全成分颗粒药房提供，由北京康仁堂药业生产。苯甲酸利扎曲普坦片（欧立停），规格:5 mg/片，欧立制药有限公司，批号:150702。

1．3 试剂与仪器 硝酸甘油注射液，规格5 mg/mL，批号1401232，北京益民药业有限公司；TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer［without Mg2+:100 mmol/L Tris-HCl pH 8.8 at 25℃；500 mmol/L KCl，0.8%（v/v）Nonidet］、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye（sangon）；10×TAE（400 mmol/L Tris-acetate and 10 mM EDTA，pH8.0）（sangon）；pMD 18-T Vector（宝生物）；引物（sangon）；Trizol提取试剂盒；第一链cDNA合成试剂盒 （AMV First Strand cDNA Synthesis Kit）（SK2445）；溴化乙锭；琼脂糖.柱式DNA胶回收试剂盒（sangon SK8131）；一步法快速感受态细胞制备试剂盒（SK9307 sangon）；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（SK8191 sangon）。PCR反应扩增仪（美国ABI公司）；DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；YXJ-2离心机 （湘仪离心机仪器有限公司）；H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；凝胶成像系统 （上海复日科技有限公司）；TU-1901紫外分光光度计 （北京普析通用仪器有限公司）；移液器（范围100～1000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL）（加拿大BBI公司）；3730XL测序仪（美国ABI）；LightCycler480 Software Setup（Roche罗氏）。

1.4 分组及造模 清洁级雄性SD大鼠适应环境3d后，10只皮下注射0.9%氯化钠注射液2 mL/kg，每日1次，连续7 d，作为空白组；120只雄性SD大鼠分别皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg，每日1次，连续7 d，后随机分为6组，即中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、西药组、联合用药组、模型组。每组20只。

1.5 给药方法 空白组每日给予蒸馏水10 mL/kg灌胃，其余6组造模成功后每日将相应药物用蒸馏水稀释至10 mL/kg灌胃，连续7 d。中药低、中、高剂量组分别按15、22.5、30 g/kg（相当于60 kg成人日用量的6倍、9倍、12倍）予三虫半夏白术天麻汤；西药组按0.498 mg/kg（相当于60 kg成人日用量的6倍）予苯甲酸利扎曲普坦片；联合用药组予三虫半夏白术天麻汤22.5 g/kg+苯甲酸利扎曲普坦片0.498 mg/kg。模型组予蒸馏水10 mL/kg。

1.6 标本采集与检测 末次给药结束后，用1.5%戊巴比妥钠溶液（45 mg/kg）将存活大鼠采用腹腔注射法麻醉，断头处死，迅速取出脑组织，用滤纸吸尽脑组织表面的血液，在冰盘上快速去除脑膜和血管，在解剖显微镜下迅速分离包含有基底节区、纹状体及三叉神经尾核相应的低位脑干区域的脑组织，用0.9%氯化钠注射液冲洗血迹，称质量，置液氮速冻后-80℃冻存，送生工生物有限责任公司（上海）运用RT-PCR检测5-HT1B受体、5-HT1D受体基因含量。

1.7 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示。各组间进行单因素方差分析下的多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑组织5-HT1B受体表达比较 见表1。大鼠经腹腔注射硝酸甘油致偏头痛模型后，模型组5-HT1B受体表达显著低于空白组（P＜0.01）。造模并干预后，给药各组5-HT1B受体表达水平仍低于空白组，其中中药低剂量组与空白组差异无统计学意义（P＞0.05），中药中剂量组、中药高剂量组、西药组及联合用药组5-HT1B受体表达显著低于空白组（P＜0.01）。造模并给药后，中药低、中、高剂量组、西药组及联合用药组5-HT1B受体表达较模型组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠脑组织5-HT1B、5-HT1D受体平均拷贝数（±s）

表1 各组大鼠脑组织5-HT1B、5-HT1D受体平均拷贝数（±s）

与中药中剂量组比较，*P＜0.05；与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 n β-actin空白组 10 2780260±298895.22中药低剂量组 20 2758834±294363.52中药中剂量组 20 2600477±256208.42中药高剂量组 20 2776595±165308.14西药组 20 2582900±307774.15联合用药组 20 2674082±250260.05模型组 20 2769097±244673.62 5-HT1B受体拷贝数 5-HT1B受体拷贝数6121.99±1061.57 2100.06±350.35*5458.47±1225.55 2244.02±766.87*4707.14±675.55△△1316.50±195.29△4746.46±785.82△△1787.67±559.70 4980.25±910.72△△2049.12±376.43*4841.22±978.94△△2047.90±737.88*4664.85±897.62△△1824.98±1060.88

2.2 对偏头痛大鼠脑组织5-HT1D受体表达的影响见表1。大鼠经腹腔注射硝酸甘油致偏头痛模型后，干预各组5-HT1D受体表达部分升高，部分降低。其中，与空白组相比，中药中剂量组5-HT1D受体表达显著降低（P＜0.05），其余各组与空白组相比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，各组差异差异无统计学意义（P＞0.05）；与中药中剂量组相比，空白组、中药低剂量组、西药组、联合用药组较中药中剂量组5-HT1D受体基因表达显著升高（P＜0.05），中药高剂量组与中药中剂量组相比差异差异无统计学意义 （P＞0.05）。

3 讨 论

偏头痛属于严重危害人类健康的重大疾病，发病率及患病率较高。发病机制主要有血管源学说［8］、皮层扩散性抑制、三叉神经血管学说。其中，三叉神经血管学说将神经、血管、神经递质三者相结合，统一于三叉神经血管系统（受5-HT1B/1D受体调节），较好地解释了偏头痛的一些临床表现及动物实验结果［9］，也为偏头痛药物的作用机制提供了合理的解释，成为目前的主流学说［10］。该学说认为偏头痛是由于三叉神经血管系统和中枢神经系统内源性痛觉调节系统功能缺陷（与遗传有关）加之过多的内外刺激引起。

5-HT是偏头痛发作中重要的神经递质［11］，是中枢内源性镇痛系统中重要神经活性物质之一。近年来，将5-HT1B/1D受体激动剂开发为治疗偏头痛的新药［12］，其代表药物为利扎曲普坦［13］、夫罗曲坦、舒马曲坦等。现有研究者证实5-HT1B/1D受体激动剂不仅能够影响外周5-HT系统的代谢状态，提高偏头痛大鼠头痛发作期外周血中5-HT含量，而且还能抑制偏头痛发作时三叉神经节降钙素基因相关肽（CGRP）的表达［14］，从而减轻CGRP引发的神经源性炎症［15-16］。

三虫半夏白术天麻汤治疗偏头痛的疗效已在前期临床工作及研究中证实。本实验采用硝酸甘油制造偏头痛大鼠模型，研究发现造模成功后偏头痛大鼠脑组织内5-HT1B/1D受体表达下降，这是造模成功的重要标志。经三虫半夏白术天麻汤干预后，各组5-HT1B受体表达都有一定程度升高，以中药低剂量组升高幅度最大，但不具有显著差异，表明三虫半夏白术天麻汤具有类似5-HT1B受体激动剂的作用，且效果与剂量相关。

大鼠经腹腔注射硝酸甘油致偏头痛模型后，中药低剂量组5-HT1D受体表达升高，其余各组表达降低，其中以中药中剂量组5-HT1D受体表达降低幅度最明显。结果表明本方对5-HT1D受体的表达具有双向调节的作用，临床用于治疗偏头痛，剂量不宜偏大。

通过本实验研究，证实了5-HT1B/1D受体调节异常为偏头痛的发病环节之一。三虫半夏白术天麻汤可以提高偏头痛大鼠脑组织5-HT1B受体的基因表达，对5-HT1D受体的基因表达具有双向调节作用。临床运用，本方剂量不宜过大。研究为本方的临床运用提供了确切的实验依据。

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Experimental Study on the Effect of Sanchong Banxia Baizhu Tianma Decoction on the Expression of 5-HT1B/1D Receptor in the Brain of Rats with Migraine

CHEN Shaomei，WEI Qizhi，XI Shengyan，et al. Xiamen Hospital Affiliated to Fujian University of TCM，Fujian，Xiamen 361009，China.

Objective:To explore the mechanism of Sanchong Banxia Baizhu Tianma Decoction in the treatment of migraine.Methods:Migraine model of SD rats were set up with nitroglycerin，given Banxiabaizhutianma decoction of high，medium and low-dose intervention respectively for 7 days，taking Rizatriptan Monobenzoate as a positive control drug medicine，compared with the blank control group and the model group.RT-PCR was used to test the genetic expression of the 5-HT1B receptor and the 5-HT1D receptor.Results:The influence on the expression of the 5-HT1B receptor:compared with the blank control group，the model group was significantly lower than the control group（P＜0.01）；there was no significant difference between traditional Chinese medicine lowdose group and the blank group（P＞0.05）；traditional Chinese medicine medium dose group，high dose group，western medicine group and the combination group were significantly lower than the blank control group（P＜0.01）；after creating the model and finishing the administration，the expression rose high in low，medium and high dose groups of traditional Chinese medicine，western medicine group and the combination group，compared with the model group，without significant difference（P＞0.05）.The influence on the expression of 5-HT1D receptor: compared with the blank control group，traditional Chinese medicine medium dose group decreased significantly（P＜0.05）；other groups had no significant differences，compared with the control blank group（P＞0.05）；compared with the model group，there was no significant difference among them （P＞0.05）；compared with the traditional Chinese medicine medium dose group，the blank control group，traditional Chinese medicine low dose group，western medicine group and combination group were significantly higher（P＜0.05）；there was no difference between traditional Chinese medicine high-dose group and the traditional Chinese medium-dose group（P＞0.05）.Conclusion:5-HT1B/1D receptor dysregulation is one cause of the pathogenesis of migraine.Sanchong banxia baizhutianma decoction can improve the genetic expression of 5-HT1B receptors in migraine rats′brains，and has a dual-direction regulation on genetic expression of the 5-HT1D receptors.In the field of clinical application，the dose should not be too large.

5-HT1B/1D receptor agonist；Rizatriptan Monobenzoate；Migraine；Traditional Chinese medicine；Sanchong Banxia Baizhu Tianma Decoction

·研究报告·

R285.5

A

1004-745X（2016）10-1874-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.012

2012福建省中医药科研课题（wst201211）

△（电子邮箱：csmxm79@126.com）

（2016-05-06）