虫草益肾颗粒对高糖培养下人肾小球系膜细胞增殖和CAT、MDA表达水平的影响*

宋立群刘 爽宋业旭贠 捷张 睿栾仲秋△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

虫草益肾颗粒对高糖培养下人肾小球系膜细胞增殖和CAT、MDA表达水平的影响*

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（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

目的 观察虫草益肾颗粒对高糖培养下人肾小球系膜细胞（HMC）的增殖及过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）表达水平的影响，探讨其防治糖尿病肾病（DKD）的作用机制。方法 将HMC随机分为6组:正常组、高糖组、福辛普利组、虫草益肾颗粒低、中、高剂量组，分别给予相应的含药血清处理后，用2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐（CCK-8）检测24 h、48 h及72 h细胞增殖情况；收集48 h和72 h细胞上清液，用比色法分别检测各组CAT、MDA的表达水平。结果 HMC经高糖刺激后表现出明显增殖现象，且在24～48 h时增殖速度最快，48～72 h时增殖速度受抑制。各治疗组对高糖刺激下的HMC增殖均有抑制作用（P＜0.01），且虫草益肾颗粒对HMC增殖的抑制作用呈时间与剂量依赖性关系。48 h、72 h时，与正常组比较，各组的CAT活性均明显下降（P＜0.01），各组的MDA含量均明显上升（P＜0.01），与高糖组比较，福辛普利组、虫草益肾颗粒低、中、高剂量组的CAT活性有明显上升趋势（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量有明显下降的趋势（P＜0.01）。结论 虫草益肾颗粒益肾颗粒防治DKD的作用机制可能与促进自由基清除，抑制或阻断自由基引起的脂质过氧化反应，增强CAT活性，提高机体抗氧化能力有关。

虫草益肾颗粒 肾小球系膜细胞 糖尿病肾病 氧化应激

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病最严重的慢性微血管并发症之一，现已成为终末期肾病（ESRD）患者的最常见病因［1］。DKD的基本病理改变为细胞外基质聚集，基膜增厚，晚期出现弥漫性肾小球硬化，最终导致肾衰竭［2］。在这一变化中，肾小球系膜细胞（MC）起了重要的作用，所以，利用体外培养MC进行细胞生物学研究，对深入了解肾脏病理生理变化及发病机制具有十分重要的作用［3-4］。近年来，关于DKD发病机制的研究显示，细胞的氧化应激反应对糖尿病微血管并发症的病情发展起着重要作用，氧化反应可使肾脏细胞内的抗氧化酶发生糖化或氧化，肾组织抗氧化能力降低［5］。而高糖、血管活性物质以及细胞因子等因素是刺激MC的主要因素。本研究在既往研究的基础上［6-7］，通过观察虫草益肾颗粒含药血清对高糖培养下人肾小球系膜细胞（HMC）增殖和氧化应激的影响，探究虫草益肾颗粒防治DKD的作用机制，寻找DKD新的抗氧化治疗方案，为虫草益肾颗粒的进一步开发研究及临床应用提供有力的实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠50只，体质量（220±20）g，购于哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心，许可证号:SCXK（黑）2015-001。饲养温度:（20±2）℃。相对湿度:30%～35%，通风良好，自然光照。动物实验室为清洁级。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的 《关于善待实验动物的指导性意见》［8］。

1.2 试药与仪器 虫草益肾颗粒（组成:发酵虫草菌丝粉、黄芪、猫须草、制大黄、水蛭）由黑龙江中医药大学药学院制备，规格为12 g/袋，发酵虫草菌丝粉由江西金水宝制药有限公司提供，其余药材饮片均从黑龙江中医药大学附属第一医院中草药局一次性选购。福辛普利（蒙诺）购于中美上海施贵宝制药有限公司，规格:10 mg/片，批号:1405054。改良型RPMI-1640培养液，胎牛血清（FBS），胰酶，PBS，均为Hy Clone公司产品（美国），购自上海恒斐生物科技有限公司（北京）。细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒CCK-8:日本同仁；25 cm2一次性培养瓶，96孔板，24孔板:美国Corning公司；细胞级葡萄糖干粉:美国SIGMA公司。丙二醛（MDA）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。倒置相差显微镜（ZEISS公司，Vert.A1），超净工作台（北京王堂蓝翼科技有限公司，WT-IND），低速水平台式离心机（上海安亭科学仪器厂，TDL-4），二氧化碳培养箱（上海力申科学仪器有限公司，HF 151UV），电热恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司，HWS-24），紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司，UV754N）。酶标仪（芬兰Labsystems公司，Multiskan 354）。

1.3 含药血清的制备 健康雄性Wistar大鼠50只，适应性喂养1周，随机分为5组:正常组，福辛普利组，虫草益肾颗粒低、中、高剂量组。按人与大鼠体表面积换算等效剂量法，以成人临床等效剂量为低剂量组［3.24 g/（kg·d）］，低剂量组2倍为中剂量组 ［6.48 g/（kg·d）］，低剂量组的4倍为高剂量组［12.96 g/（kg·d）］，福辛普利组［0.9 mg/（kg·d）］灌胃，正常组给予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃，每组每日灌胃1次，连续给药7 d，自由饮食。于末次给药后2 h，在无麻醉情况下予以眼眶取血，3000 r/min离心15 min取上清液，将各组相同时间点的药物血清混合，56℃水浴锅30 min灭活补体，超净台内经0.22 μm孔径针头过滤器过滤除菌，分装后-80℃冻存备用。

1.4 细胞培养 HMC 7～10代，由哈尔滨医科大学附属第二医院肾内科焦军东教授惠赠，接种于含10%的FBS的RPMI-1640培养液的25 cm2培养瓶中培养，培养箱环境:37℃、含5%CO2、恒温。细胞培养至生长状态良好，至对数生长期时进行实验。

1.5 分组与给药 将正常培养的HMC随机分为6组:正常组 （含10%正常大鼠血清+RPMI-1640培养液），高糖组 （含10%正常大鼠血清+30 mmol/L葡萄糖+RPMI-1640培养液），福辛普利组（含10%福辛普利含药血清+30 mmol/L葡萄糖+RPMI-1640培养液），虫草益肾颗粒低剂量组（含10%虫草益肾颗粒低剂量大鼠血清+30 mmol/L葡萄糖+RPMI-1640培养液），虫草益肾颗粒中剂量组（含10%虫草益肾颗粒中剂量大鼠血清+30 mmol/L葡萄糖+RPMI-1640培养液），虫草益肾颗粒高剂量组（含10%虫草益肾颗粒高剂量大鼠血清+30 mmol/L葡萄糖+RPMI-1640培养液）。

1.6 观察项目 1）CCK-8法检测不同处理方法对HMC增值的影响:待细胞生长进入对数生长期时，用0.25%的胰酶消化后吹散成单细胞悬液，以7～8×103/孔接种于96孔板中，置培养箱中培养至细胞贴壁，换无血清RPMI-1640培养液培养24 h，同步化各组细胞。按24 h、48 h、72 h 3个时间点分3块96孔板，每块板随机分成6组，每组设10个副孔，按组分别加入配置好的含不同药物血清浓度的培养液，置入培养箱中培养。待到指定时间点（24 h、48 h、72 h）时，每孔加入10 μL CCK8溶液，置于培养箱中孵育4 h后取出，用酶标仪检测在450 nm波长时各孔吸光度。2）MDA、CAT检测:待细胞生长进入对数生长期时，用0.25%的胰酶消化后吹散成单细胞悬液，以（2～3）×104接种于24孔板中，置培养箱中培养至细胞贴壁，换无血清RPMI-1640培养液培养24 h，同步化各组细胞，按上述方法分组与给药，每组设8个副孔，并于48 h、72 h分别收集各组细胞上清液，1500 r/min离心10 min后待测。采用比色法测细胞上清液中MDA、CAT水平，均严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，多组数据之间采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnet t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组含药血清对HMC在不同作用时间点细胞增殖的影响 见图1，表1。与正常组比较，高糖（30 mmol/L）条件下，HMC在24 h、48 h、72 h 3个时间点均有细胞增殖的效应，差异有统计学意义（P＜0.01）。尤其在24～48 h时HMC增殖速度最快，而48～72 h时，高糖环境下细胞增殖速度降低。高糖组内HMC在48 h与72 h的增殖情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在24 h时，与高糖组相比，福辛普利组、虫草益肾颗粒低、中剂量组对HMC的增殖作用未起到明显的抑制效应 （P＞0.05），而虫草益肾颗粒高剂量组的OD值降低 （P＜0.05），可有效抑制HMC的增殖。随着给药时间的延长，48 h和72 h时，与高糖组比较，福辛普利组与虫草益肾颗粒低、中、高剂量组均出现了对HMC生长的抑制作用（P＜0.05或 P＜0.01），提示虫草益肾颗粒对高糖条件下HMC生长抑制作用有剂量-效应依赖关系及时间-效应依赖关系。

图1 不同时间高糖对人肾小球系膜细胞CCK-8的OD值影响

表1 各组含药血清对HMC在不同时间点OD值比较（±s）

表1 各组含药血清对HMC在不同时间点OD值比较（±s）

与正常组同时间比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与高糖组同时间比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与同组48 h比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

组别 n 72 h正常组 10 0.988±0.094高糖组 10 1.393±0.069**福辛普利组 10 1.111±0.122**△△▲24 h 48 h 0.339±0.085▲▲0.975±0.136 0.663±0.108**▲▲1.373±0.098**0.573±0.119**▲▲1.215±0.108**△△虫草益肾颗粒低剂量组 10 1.206±0.051**△△0.633±0.100**▲▲1.251±0.117**△虫草益肾颗粒中剂量组 10 0.614±0.099**▲▲1.221±0.116**△1.149±0.069**△△▲虫草益肾颗粒高剂量组 10 0.515±0.055**△△▲▲1.184±0.093**△△1.096±0.059*△△▲

2.2 各组含药血清对HMC的CAT活力和MDA含量影响 见表2。1）各组CAT活力的比较，48 h或72 h时，与正常组比较，高糖组、福辛普利组、虫草益肾颗粒低、中、高剂量组的CAT活力均明显下降（P＜0.01），提示在高糖环境下，HMC的抗氧化能力下降。与高糖组比较，福辛普利组、虫草益肾颗粒低、中、高剂量组的CAT活性有明显上升趋势（P＜0.05或P＜0.01），提示各治疗组均有疗效，可改善HMC抗氧化能力。其中以福辛普利组和虫草益肾颗粒高剂量组效果最明显。2）各组MDA含量的比较，48 h或72 h时，与正常组比较，高糖组、福辛普利组、虫草益肾颗粒低、中、高剂量组的MDA含量均明显上升（P＜0.01），提示高糖环境下，HMC的脂质过氧化程度明显加剧。与高糖组比较，福辛普利组、虫草益肾颗粒低、中、高剂量组的MDA含量有明显下降的趋势（P＜0.01），提示各治疗组均有疗效，可减轻活性氧对生物膜的损伤，其中以虫草益肾颗粒高剂量组的疗效最显著。

表2 各组含药血清对人肾小球系膜细胞CAT活力和MDA含量的影响（±s）

表2 各组含药血清对人肾小球系膜细胞CAT活力和MDA含量的影响（±s）

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3 讨 论

本实验通过观察HMC在高糖环境下3个时间点（24 h、48 h、72 h）的增殖情况，发现在早期（24～48 h）系膜细胞增殖速度增快，而长期（48～72 h）高糖环境下细胞增殖速度降低，由此可见，高糖环境下HMC的增殖呈现双相过程［9-11］，并证实了高糖刺激HMC增殖研究选择的时间点有意义。本实验结果显示:48 h的高糖组与72 h的高糖组比较，HMC的增殖情况变化不明显，对于同一处理因素（同一给药组）的不同作用时间（48 h、72 h）下的两组，可进行观察同一处理因素在不同作用时间对指标的影响，结果提示，在同一药物浓度作用下，比较不同作用时间组（48 h或72 h），发现作用72 h的要比作用48 h的疗效更好 （即HMC增殖受抑制更明显），故可认为虫草益肾颗粒的效果具有时间依赖性。在同一作用时间（48 h或72 h），比较虫草益肾颗粒不同剂量组细胞增殖情况，发现随着剂量的增高，HMC的增殖情况呈下降趋势，且差异有统计学意义，故可认为虫草益肾颗粒的效果具有浓度依赖性。

正常情况下，机体具有一个完整的抗氧化防御系统，可通过抗氧化清除活性氧，使细胞的氧化和还原处于动态平衡［12］。人体存在两类抗氧化系统［13］:一类是酶抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和CAT；另一类是非酶抗氧化系统，包括维生素C、维生素E、褪黑色素、类胡萝卜素等。其中，CAT是一种以铁卟啉为辅基的酶，它能催化H2O2释放新生态氧以氧化某些酚类和胺类物质，使其失去活性氧的作用，保护机体［14］，因此，CAT活力的高低可间接反映细胞抗氧化能力的强弱［15］。MDA是氧自由基攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用并因此形成的脂质过氧化物，测试MDA的含量可反映机体内脂质过氧化的程度以及细胞膜损伤的程度，并间接反映体内氧自由基的水平，体内自由基长期维持高水平的结果是导致酶抗氧化系统活性下降［16-17］，损伤机体。本研究结果表明，在高糖条件下，HMC增殖明显，并产生了大量的自由基，对DNA、蛋白质和生物膜的损伤增加，MDA升高，CAT活性下降，观察48 h、72 h各给药组的指标变化，与高糖组比较各治疗组的CAT活力均升高、MDA含量均减少，且随着虫草益肾颗粒药物浓度的增加或时间延长，MDA含量显著降低，表明细胞内抗氧化物酶活性增强，对自由基的清除能力上升，由此可推断，虫草益肾颗粒可抑制HMC增殖，并可改善高糖作用下引起的氧化应激反应，使CAT活性增高、MDA明显降低，这可能是虫草益肾颗粒所含成分具有明显的抗氧化作用，中药清除超氧自由基、过氧化氢、差羟自由基等，使得CAT活力增加，也减少了氧自由基对组织和细胞的攻击，使MDA含量下降，进而达到防治DKD的功效。

虫草益肾颗粒由发酵虫草菌丝粉、黄芪、猫须草、制大黄、水蛭5味中药组成，方中虫草为君药，补肺、益肾；黄芪、制大黄为臣，补脾、活血、泄浊；猫须草（别名肾茶）、水蛭为佐使，利湿、破血逐瘀、芳化湿浊，全方温、清、补、消并用，共奏养护正气、祛痰逐瘀、推陈致新之功效，对治疗DKD患者正虚不足，痰瘀互结，久病失养有明显疗效［18］。通过实验研究证实，虫草益肾颗粒能抑制高糖环境下HMC的过度增殖，增强CAT活力，通过清除超氧自由基、过氧化氢、羟自由基等，减缓肾小球硬化，延缓病情进展，起到保护肾脏的作用。与西药比较中医药防治慢性肾脏病具有多靶点，不易产生耐药性，长期使用副作用少，临床疗效肯定等优点，因此，对虫草益肾颗粒进行基因、蛋白水平的进一步研究具有重要意义，以期待寻找其抗氧化防治DKD的具体靶点和作用机制，这将是我们今后研究的主要目标与方向。

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Effect of Chongcao Yishen Decoction on HMC Proliferation and Expression of CATMDA

SONG Liqun，LIU Shuang，SONG Yexu，et al. Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China.

Objective:To observe the effect of Chongcao Yishen Decoction on HMC proliferation and expression of CATMDA and to explore the mechanism of Chongcao Yishen Decoction in the treatment of DKD（Diabetic kidney disease）.Methods:HMC were divided into six groups:the control group，the glucose group，Fosinopril group，and the Chongcao Yishen Decoction low，medium and high dosage groups.Cells were collected after respectively given the appropriate treatment.The human glomerular mesangial cells proliferative degree within 24，48 and 72 hours were detected by CCK-8 colorimetry；cells supernatant in 48 and 72 hours was collected，and according to the specifications，the expression of CATMDA was detect with colorimetric method（DNS method）. Results:In vitro cultured glomerular mesangial cells were obviously proliferated under the stimulation of high glucose.In the period from 24 h to 48 h，the speed of proliferation was highest，while in the period from 48 h to 72 h，the speed was inhibited.Each group had an inhibition on proliferation of HMC under the stimulation of high glucose（P＜0.01）.Chongcao Yishen Decoction had a significant inhibition on proliferation of HMC，and certain time and dose dependence has been detected.In 48 and 72 hours，compared with control group，CAT activity of other groups was significantly decreased（P＜0.01）；the expression of MDA was significantly increased（P＜0.01）. Compared with the high glucose group，CAT activity in Fosinopril group and Chongcao Yishen Decoction low，medium and high dosage groups obviously tend to ascent（P＜0.05 or P＜0.01）；the expression of MDA had a significant lower tendency（P＜0.01）.Conclusion:The possible therapeutic mechanism of Chongcao Yishen Decoction for DKD is related to inhibiting lipid peroxidation，eliminating free radicals，raising CAT activities and im-proving the antioxidant capacity.

Chongcao Yishen Decoction；Human glomerular memangial cell；Diabetic kidney disease；Oxidative stress

·研究报告·

R587.2

A

1004-745X（2016）10-1833-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.001

国家自然科学基金项目（81273911）；教育部高等学校博士学科重点专项科研基金资助项目（20112327110002）；黑龙江中医药大学研究生创新科研项目（yjscx2016005）

△（电子邮箱：530542700@qq.com）

（2016-06-20）