桂花优良品种‘珍珠彩桂’遗传多样性的ISSR分析及指纹图谱构建

乔中全， 王晓明， 李永欣， 蔡 能， 曾慧杰， 王湘莹 (湖南省林业科学院 林木无性系育种技术湖南省重点实验室， 湖南 长沙 410004)

桂花优良品种‘珍珠彩桂’遗传多样性的ISSR分析及指纹图谱构建

乔中全， 王晓明， 李永欣， 蔡 能， 曾慧杰， 王湘莹
(湖南省林业科学院 林木无性系育种技术湖南省重点实验室， 湖南 长沙 410004)

利用ISSR分子标记技术对44个桂花品种进行遗传多样性研究，从100条引物中筛选出10条引物对供试材料基因组总DNA进行PCR扩增，共扩增出条带122条，其中多态性条带112条，多态性比例为91.8%。经PopGen32软件包分析，44个桂花品种的平均有效等位基因数为1.592 8，平均Nei’s基因多样性指数为0.341 9，平均Shannon信息指数为0.506 3，遗传一致度介于0.475 4～0.926 2之间，说明桂花品种间遗传多样性较高。UPGMA聚类将44个品种分成7类。建立了新品种‘珍珠彩桂’和其它43个桂花品种的DNA指纹图谱，可从分子水平将‘珍珠彩桂’与现有其它桂花栽培品种进行鉴别。研究结果为桂花分类、品种鉴定、分子育种和子代鉴定提供了重要依据。

桂花； ISSR； 遗传多样性； 指纹图谱

桂花(Osmanthusfragrans)为木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus)常绿植物，花簇生，香味浓郁，在我国有2 500余年的栽培历史，是我国十大传统名花之一，也是优良的园林绿化树种和香料植物[1]。目前，我国桂花品种记载的有170多个[2]。在长期栽培过程中，由于自然杂交、人工选择及其它环境因素的影响，许多性状发生变异，品种资源越来越丰富[3-4]。长久以来，都是以形态学为基础对桂花品种进行分类，以叶、枝条、花、营养器官的特征及花期的早晚等为依据，将桂花分为4个品种群：金桂品种群、银桂品种群、四季桂品种群和丹桂品种群[5-8]。由于研究者对桂花品种变异和进化规律掌握不够清楚，导致不同地区的桂花品种很难进行比较，同物异名和同名异物的现象非常严重[4]，制约了桂花良种选育的进程。因此，使用现代生物学—分子标记技术，开展桂花品种分子标记研究，构建桂花品种指纹图谱，有利于从分子水平进行桂花品种鉴别，促进桂花新品种选育。国内外有利用同工酶与RAPD分子标记进行桂花品种分类[9-10]的报道，目前，使用ISSR标记技术构建桂花DNA指纹图谱进行品种鉴定的报道还很少。ISSR标记技术克服了RAPD和RFLP的限制[11-12]，具有操作简单、费用低、重复性好、稳定性高和多态性水平高等特点，能够检测出丰富的遗传多样性。本研究利用ISSR分子标记技术对‘珍珠彩桂’等44个桂花品种进行分子标记研究，建立‘珍珠彩桂’等桂花品种的DNA指纹图谱，为‘珍珠彩桂’及其它桂花植物的品种鉴定、种质资源的保护和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1供试材料

材料为44个桂花品种(见表1)，均于2014年4月取自常州市开心农场，将叶片用硅胶干燥后带回实验室，保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2基因组DNA提取

按照北京天根生物有限公司的植物DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit、离心柱型)的说明书进行基因组DNA的提取。

1.3引物筛选

实验所用引物为加拿大哥伦比亚大学(University of British Columbia Biotechnology，UBC)公布的植物通用ISSR引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。从100条引物中筛选出扩增效果好的10条引物(见表2)。参考Tm值，采用梯度PCR确定不同引物的退火温度。

1.4ISSR-PCR扩增

表1 供试材料Tab 1 MaterialsusedinISSRanalysis品种群品种品种代码品种群品种品种代码银桂无名银桂11日香桂29无名银桂33红日香桂30籽银桂16金桂籽金桂11七月银桂17曲叶金桂15无名银桂2525红双喜43白洁27沉香桂32柳叶银桂33苏金桂22早银桂40小叶檀香8丹桂大叶丹桂4大叶檀香13丹桂5柳叶金桂35朱砂桂6无名金桂37大花丹桂7无名籽金桂38早龙朱砂桂12老金桂44堰红桂19小叶金桂24状元红2二叶金9软叶丹桂34其它品种珍珠彩桂21橡皮朱砂桂41反红黄桂10四季桂天香台阁18青山桂26老四季桂23皖白桂31老四季桂28红花籽蕾36月月桂42无名桂花2020佛顶珠14无名桂花3939

表2 ISSR引物名称及序列Tab 2 ThenameandsequenceofISSRprimers引物编号序列Tm值(℃)退火温度(℃)UBC810GAGAGAGAGAGAGAGAT5251UBC811GAGAGAGAGAGAGAGAC5050UBC815CTCTCTCTCTCTCTCTG5251UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT5051UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGYC5050UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT5252UBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYC5254UBC842GAGAGAGAGAGAGAGAYG5253UBC855ACACACACACACACACYT5053UBC856ACACACACACACACACYA5152

反应体系20 μL：30 ng模板DNA、0.60 μmol/L引物、1.5U TaqDNA聚合酶、0.20 mmol/L dNTPs、10×PCR buffer(Mg2+free)、2.0 mmol/L MgCl2、无菌水。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min、 94 ℃ 30 s、50～54 ℃(不同引物不同退火温度)45 s、72 ℃ 1.5 min、 35个循环、72 ℃ 2 min、4 ℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测、凝胶成像仪拍照记录。所有实验重复2次以上。

1.5数据处理与分析

统计清晰度高、重复性好、分辨率高的条带计为1，条带不清楚或没有的计为0，建立原始数据矩阵。用PopGen32分析软件对数据进行分析，用UPGMA法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1ISSR多态性

44个样本中，10条引物共扩增出122条效果好的条带，其中112条为多态性条带，分子量在200～3 000 bp之间(见表3、图1)，平均每条引物可扩增出12.2条带，11.2条多态性条带，多态性比率(PPB)为91.8%。

表3 ISSR引物扩增结果及多态性Tab 3 Amplificationresultandpolymorphismofinter⁃simplesequencerepeat(ISSR)primers引物扩增总条带数多态性条带数多态性比率(%)UBC810111090 91UBC81112975 00UBC8151212100 00UBC834121191 67UBC8351212100 00UBC84012975 00UBC841121191 67UBC8421212100 00UBC8551212100 00UBC856151493 33总计12211291 80

图1 UBC834扩增结果Fig.1 Amplified result of primer UBC834

2.2桂花品种间遗传多样性分析及聚类分析

通过PopGen32软件对桂花品种分析，44个桂花品种的平均观测位点数Na为1.918 0，有效等位位点数Ne为1.592 8，Nei’s基因多样性H为0.341 9，Shonnon’s 信息指数为0.506 3，遗传一致度介于0.475 4～0.926 2之间。其中，大叶丹桂和朱砂桂遗传相似系数最高为0.926 2；天香台阁与月月桂的相似性系数最低为0.475 4。

根据桂花品种间的遗传相似系数，按UPGMA法进行聚类分析(见图2)。从聚类图可以看出，在相似性系数0.706处可将所有品种分为7个类群。第一类主要包括丹桂品种群的状元红、大叶丹桂、朱砂桂、丹桂、大花丹桂、早龙朱砂桂、堰红桂，金桂品种群的大叶檀香、小叶檀香、籽金桂、二叶金，四季桂品种的佛顶珠和天香台阁，银桂品种群的无名银桂1和无名银桂3，其它桂花品种群中的反红黄桂；第二类包括曲叶金桂、籽银桂和七月银桂三个品种；第三类是无名桂花20，单独聚为一类；第四类包含苏金桂、无名银桂25、四季桂、青山桂、白洁、小叶金桂、老四季桂和日香桂；第五类含有红日金桂、皖白桂、沉香桂、柳叶金桂、柳叶银桂、软叶丹桂、无名籽金桂38、红花籽蕾、无名金桂37和无名桂花39；第六类含有珍珠彩桂、橡皮朱砂桂、月月桂和早银桂；第七类为金桂的两个品种，红双喜和老金桂。

图2 ISSR分子聚类分析Fig.2 Dendrogram of UPGMA cluster based on ISSR Markers

2.3桂花品种鉴定

利用10条ISSR引物对44个桂花品种进行鉴定，结果表明，每条引物鉴定桂花品种的数量在22-44个之间，存在很大的差异，鉴定数量最多的是UBC856，共鉴定出44个桂花品种，鉴定数量最少的是UBC815、UBC834和UBC855，仅鉴定出22个桂花品种(见表4)。有5条引物可鉴定出30个以上桂花品种，分别是UBC810、UBC840、UBC841、UBC842和UBC856，表明筛选出的ISSR引物能很好地进行桂花品种鉴定。

表4 ISSR引物对桂花品种鉴定Tab 4 IdentificationofvarietiesofOsmanthusfragransbasedonISSRprimers引物编号鉴定数量鉴定品种编号UBC810341、3、8、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44UBC811252、5、8、11、12、14、17、18、19、20、23、24、26、27、28、29、30、32、34、36、39、40、41、42、44UBC815221、2、3、6、9、12、14、17、18、19、21、22、25、28、29、32、34、36、38、39、41、42、43UBC834221、2、15、16、17、20、22、23、26、28、29、30、31、33、36、37、38、39、40、42UBC835261、3、7、8、11、12、15、16、17、18、22、23、24、25、27、31、32、33、35、36、37、38、39、40、43、44UBC840301、3、9、10、14、17、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44UBC841301、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、31、35、36、37、40、41、42、UBC842381、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、43、44UBC855221、6、10、12、15、20、21、22、23、25、27、28、30、31、32、33、35、36、38、40、43、44UBC856441、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44

2.4桂花品种DNA指纹图谱构建

10条ISSR引物中，UBC856能够将44个品种进行很好地鉴定，因此，利用UBC856对44个桂花品种进行DNA指纹图谱构建。UBC856对44个桂花品种均能进行很好的扩增，扩增片段长度在300～1700 bp之间，条带清晰，多态性条带丰富。片段长度小于300 bp或大于1700 bp，扩增片段模糊不清，因此不予统计。根据扩增条带的有无，有条带记为“1”，没条带记为“0”，建立44个桂花品种的计算机化DNA指纹图谱，如表5所示。

表5 桂花品种的计算机化DNA指纹图谱Tab 5 ThecomputerizedDNAfingerprintofvarietiesofOsmanthusfragrans编号名称计算机化DNA指纹图谱编号名称计算机化DNA指纹图谱编号名称计算机化DNA指纹图谱1无名银桂101100110101110013大叶檀香00011111100110125无名银桂250000001000111012状元红01101110101110014佛顶珠01111110101110026青山桂0000001011011113无名银桂300101011101111115曲叶金桂00001111001111027白洁0000001001011014大叶丹桂01101111111110116籽银桂00000111101110028四季桂0000011110111115丹桂01101111101110117七月银桂01111011100101029日香桂0100101001011106朱砂桂00111111101110018天香台阁11001010101111130红日香桂0000101000111007大花丹桂01101110101111119堰红桂00001110101110131皖白桂0000111000011118小叶檀香00001010101110020无名桂花2000100111010111032沉香桂0100101001011019二叶金00000011101111121珍珠彩桂00000110110111133柳叶银桂01001110000110110反红黄桂01011110101110122苏金桂00000010001111134软叶丹桂00000110011111111籽金桂00001110101110123老四季桂01000110100111035柳叶金桂00001010010110112早龙朱砂桂01011110101111024小叶金桂01000110100111136红花籽蕾010000100001110

续表5 桂花品种的计算机化DNA指纹图谱ContinuedTab 5 ThecomputerizedDNAfingerprintofvarietiesofOsmanthusfragrans编号名称计算机化DNA指纹图谱37无名金桂00000110010110138无名籽金桂01001111010111139无名桂花3901001110010110140早银桂01001110000111041橡皮朱砂桂00001010001110142月月桂00000110000111043红双喜11000111010111044老金桂110011100101100

3 结论与讨论

采用ISSR分子标记技术对44个桂花品种进行遗传多样性分析，得到的多态性条带比率(PPB)达到91.8%，说明桂花品种间的变异较大，品种资源较丰富。这与我国劳动人民长期的栽培和选育密切相关。聚类分析结果(见图2)表明，花色较深的金桂品种群和丹桂品种群中的多个品种往往聚在一起，说明这两个品种群中某些品种有较近的亲缘关系，这与赵小兰等[13]同工酶分析、韩远记等[14]AFLP聚类分析及邱英雄等[15]ISSR聚类分析的结果基本一致。花色较浅的银桂品种群和四季桂品种群中的多个品种聚在一起，说明某些花色较浅的品种之间遗传变异程度较低，存在着较近的亲缘关系。而银桂中的某些品种与金桂和丹桂类品种又有较高的遗传相似度，表明基于形态学的品种分类体系与基于ISSR标记的品种分类体系不一致。本研究中所用的珍珠彩桂为新选育出的桂花新品种，其究竟属于哪一个桂花品种群目前一直没有确定。从聚类结果看，珍珠彩桂与橡皮朱砂桂、月月桂和早银桂聚为一类，并不能判断珍珠彩桂属于哪个品种群，但在遗传距离较远处珍珠彩桂又与花色较浅的品种聚为一类，因此结合其开花特性将其归为银桂品种群。由此可见单独的ISSR分子标记并不能确定其品种群的归属。

本研究利用ISSR分子标记技术建立了珍珠彩桂及其它43个桂花品种的DNA指纹图谱，可以将桂花品种很好地区分开。本研究所选的10条引物中有5条能单独区分出30个以上品种，鉴定品种最多的是引物UBC856，可以鉴定出全部44个品种。构建桂花DNA指纹图谱，有利于桂花品种鉴定和真伪辨别，有利于桂花新品种培育，子代检测、鉴定，同时还可为桂花杂交育种提供指导，具有重要意义。

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GeneticdiversityandfingerprintconstructionofvarietiesofOsmanthusfragrans‘ZhenzhuCaigui’byISSRmarkers

QIAO Zhongquan， WANG Xiaoming， LI Yongxin， CAI Neng， ZENG Huijie， WANG Xiangying

(Hunan Academy of Forestry，Trees Clones Breeding Technology Key Laboratory of Hunan Province，Changsha 410004，China)

The genetic diversity of 44 varieties ofOsmanthusfragranswas analyzed by inter-simple sequence repeats(ISSR).10 ISSR primers which were selected from 100 ISSR primers were amplified by PCR.A total of 122 bands were amplified，112 of which were polymorphic bands，polymorphic ratio was 91.8%.After PopGen32 package analysis，the average effective number of alleles 44Osmanthusfragranswas 1.592 8，the average Nei’s genetic diversity index was 0.341 9，the average Shannon information index was 0.506 3，genetic identity between 0.475 4～0.926 2.This showed a high genetic diversity amongOsmanthusfragrans.These 44 varieties ofOsmanthusfragranswere divided into seven groups by UPGMA based on the similarity coefficient.The fingerprint of 44 varieties ofOsmanthusfragranswas established.The result could be used as a basis for classification ofOsmanthusfragrans，variety identification，molecular breeding and offspring identify.

Osmanthusfragrans； ISSR； genetic diversity； fingerprint

2016-03-23

长沙市科技计划重点项目(科051003-22)。

乔中全(1985-)，男，山东曹县人，硕士，助理研究员，研究方向为植物分子育种。

S 685.13

A

1003 — 5710(2016)03 — 0001 — 05

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2016. 03. 001

(文字编校：张 珉)