低温对小鼠骨髓源树突状细胞生物特性的影响

邓汝淇，胡何节，方征东，王晓天，孙小杰，葛新宝

低温对小鼠骨髓源树突状细胞生物特性的影响

邓汝淇，胡何节，方征东，王晓天，孙小杰，葛新宝

取C57BL/6小鼠骨髓细胞，在不同时期进行低温冻存的条件下对其进行诱导和培养，获得树突状细胞（DCs）。经过冻存的DCs复苏后存活率差异无统计学意义；各组DCs均高表达CD11c，低表达CD80、CD86及主要组织相容性复合体-Ⅱ（MHC-Ⅱ）分子；混合淋巴细胞反应及培养上清液中白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平的差异无统计学意义。表明在不同时期进行低温冻存的DCs仍能保持稳定的生物特性。

低温保存；树突状细胞；细胞培养

自1973年首次报道树突状细胞（dendritic cells，DCs）以来，对其进行了深入研究，是目前已知的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞（antigenpresenting cell，APC），是免疫系统的重要组成部分［1］。DCs经常被选择用于研究疾病的进展机制、癌症以及自身免疫性疾病等。目前认为下肢动脉硬化性闭塞症（atherosclerosis occlusion，ASO）是一种慢性炎症的病理过程［2］。研究［3］表明，血管树突状细胞（vascular dendritic cell，VDC）可能参与了ASO的炎症性免疫反应。外周血中DCs较少，而利用DCs进行免疫治疗的研究中需要大量DCs，为获得生物特性良好的DCs，对小鼠骨髓源DCs低温保存的研究具有重要意义，为进一步研究ASO的细胞免疫治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄SPF级健康雄性C57BL/ 6小鼠和BALB/c小鼠，约20 g，购自安徽医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 RPMI 1640全培养液、南美胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Hyclone公司；重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（recombinant murine granulocyte macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF）、重组小鼠白介素-4（rmIL-4）购自美国 Peprotech公司；流式荧光抗体 FITC antimouse CD11c、PerCP-CyTM5.5 anti-mouse CD80、APC anti-mouse CD86、PE anti-mouse MHC-Ⅱ及其同型对照抗体购自美国BD公司；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）购自日本同仁化学研究所；小鼠白介素-10 （interleukin-10）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA试剂盒购自美国R&D公司。

1.3 主要仪器 恒温细胞培养箱购自美国SHEL LAB公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；-80℃超低温冰箱购自美国Advantage公司；流式细胞仪购自美国BD公司；酶标仪购自美国BioTek公司。1.4 小鼠骨髓源DCs的培养与分组 颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠，75%酒精浸泡至少10 min，再无菌剥除小鼠股骨、胫骨上肌肉组织，PBS反复洗涤后，剪去骨干两端，RPMI 1640全培养液冲洗骨髓腔直至冲洗液变白，过滤去除组织碎片，收集滤出液获得小鼠骨髓细胞，分成正常培养组和早期冻存后培养组，早期冻存后培养组用于冻存，正常培养组经离心机1 200 r/min离心5 min后，弃上清液，用含12% FBS的RPMI 1640全培养液制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为0.5×106/ml，加入rmGM-CSF和rmIL-4（其终浓度均为20 ng/ml），置37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养，48 h后以1 200 r/min离心5 min去除上清液，并补充全培养液和细胞因子继续培养，隔日半量换液，第5天继续半量换液后从正常培养组中分出培养后冻存组，培养后冻存组经自然沉降后收集悬浮细胞用于冻存，隔日后收集细胞悬液。

1.5 细胞的冻存与复苏后培养 用于冻存的细胞离心后重悬于自制冻存液（70%RPMI 1640全培养液，20%FBS，10%DMSO），调整细胞浓度为5×109个/L，在-20℃下保存1 h后转移到-80℃超低温冰箱，24 h后转移到液氮罐中。4周后复苏。早期冻存后培养组复苏后按正常培养组步骤继续培养出DCs。培养后冻存组则用全培养液制成细胞悬液，并加入rmGM-CSF和rmIL-4，培养1 d，换液并补充细胞因子，隔日收集细胞。

1.6 观察细胞存活率 取复苏后的DCs悬液0.1 ml，加入0.8 ml PBS，再加入0.1 ml 0.4%台盼蓝染色液混匀（终浓度0.04%），染色3 min后，倒置显微镜下观察分别计数未被染色的成活细胞和染成蓝色的死细胞，计算DCs存活率。细胞存活率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。

1.7 流式细胞仪检测小鼠骨髓源DCs分子表型分别收集各组DCs悬液，调整样品细胞浓度为1× 106/ml，按照流式抗体说明书进行抗体及其同型对照标记，在4℃下避光孵育30 min，离心、洗涤并重悬于500 μl PBS液中，流式细胞仪检测各组细胞表面CD11c、CD80、CD86及主要组织相容性复合体-Ⅱ（major histocompatibility complex classⅡ，MHC-Ⅱ）分子的表达。

1.8 CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR） 无菌取BALB/c小鼠脾脏并剪碎，经研磨、过滤后获得细胞悬液，尼龙毛柱法获得同种异体T细胞（调整浓度为2×106/ml）。在1.4和1.5步骤中获得的各组DCs中，加入丝裂霉素C（终浓度为25 μg/ml），37℃下孵育45 min， PBS洗涤2遍，按1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的比例分别将DCs和T细胞加入96孔板，每组设置3个复孔，同时设DCs细胞和T细胞作阴性对照，培养液作为空白对照，两者共培养68 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续培养4 h后，用酶标仪测定450 nm处各孔光密度（optical density，OD）值。

1.9 ELISA法检测培养上清液中IL-10、TGF-β1水平 收集上述各组DCs细胞上清液，按ELISA试剂盒说明书步骤测定培养上清液IL-10、TGF-β1水平。1.10 统计学处理 每组均检测5个样本，各组间比较采用SPSS 17.0统计软件进行单因素分析，定量资料采用表示，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复苏后存活率 冻存4周后，早期冻存后培养组细胞复苏后存活率为（85±3.9）%，培养后冻存组细胞复苏后成活率为（83±6.1）%。两组冻存方法所得存活率差异无统计学意义（t=0.617，P＞0.05）。

2.2 DCs表型 分别收集各组诱导出的DCs，用流式细胞术测定其细胞表型。结果显示3组细胞均高表达CD11c，低表达CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子，均表现为未成熟状态（图1），其表达率差异无统计学意义（F=2.754、0.873、1.113、1.149，P＞0.05）。

2.3 DCs刺激增殖能力 刺激指数（stimulation index，SI）=（待测孔OD值-培养液对照组OD值）/（阴性对照组OD值-培养液对照组OD值）。结果显示同比例下早期冻存后培养组、培养后冻存组DCs刺激同种异基因T细胞增殖的能力有所下降，但与正常培养组比较差异无统计学意义，各组内不同比例间随着DCs浓度的下降，其增殖能力逐步下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.4 DCs培养上清液中细胞因子水平 用ELISA法分别测定3组DCs培养上清液中IL-10、TGF-β1细胞因子水平，3组比较差异无统计学意义（F= 1.890、1.583，P＞0.05）。见图3。

3 讨论

DCs是一种特殊的白细胞，能够时刻向免疫系统传达抗原、感染和炎症介质的出现，在先天性和获得性免疫中起着核心作用。成熟的树突状细胞（mature dendritic cells，mDCs）在效应T细胞导致的动脉粥样硬化性损伤炎症过程中扮演着关键角色，可导致斑块不稳定，严重病变处的DCs数量明显多于早期病变［4］。研究［5］显示动脉粥样硬化血管病变的加重与DCs的成熟有关，斑块内转移的mDCs数量与吸收的耐受性树突状细胞（tolerogenic dendritic cells，tolDCs）数量成负相关。mDCs与tolDCs的产生直接与病变的进程有关，因此抑制DCs的成熟和增加tolDCs的数量可能成为治疗动脉粥样硬化的一个有效手段。

图1 流式细胞术分析DCs表面分子

图2 DCs分别与同种异基因T细胞的MLR

图3 DCs培养上清液中细胞因子水平

分析未成熟树突状细胞（immature dendritic cells，imDCs）表型中CD80、CD86和MHC-Ⅱ低表达，具有tolDCs表型，通过分泌IL-10、TGF-β1，诱导调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）的生成，Tregs则能对DCs的功能及成熟、活化进行调节［6］。笔者推测对tolDCs进行研究及使用tolDCs进行细胞免疫治疗动脉粥样硬化具有可行性。进行细胞免疫治疗研究过程相对较长，需要大量生物特性相对稳定的tolDCs。低温保存是长期保存细胞重要的手段，本实验采用C57BL/6小鼠骨髓培养方法可获得大量较高纯度DCs［7］，通过两种不同的冻存方式刺激分化成DCs，并分析其生物特性。CD11c是DCs的特征性标记分子，3组DCs均表现为高表达，流式细胞术进一步检测发现3组均低表达CD80、CD86 和MHC-Ⅱ，表现为耐受性，各组间差异无统计学意义。MLR实验显示两组冻存DCs对同种异基因T细胞的刺激指数较正常组降低，但差异无统计学意义，可认为经过冻存后获得的imDCs对T细胞的刺激增殖能力无明显变化。用ELISA法测定3组DCs培养上清液中细胞因子水平表明冻存后DCs对IL-10、TGF-β1的分泌功能无明显变化。MLR和ELISA实验表明经过低温保存的DCs和小鼠骨髓经低温保存后分化成的DCs能够诱导Tregs的生成，可以用于小鼠动脉粥样硬化的细胞免疫治疗。

综上所述，经过低温保存的DCs和小鼠骨髓经低温保存后分化成的DCs其生物特性与未经过低温保存的DCs之间差异无统计学意义，进行DCs的冻存后，可大量储存生物特性稳定的DCs，避免了因不同培养批次间DCs生物特性之间的差异，节约了实验资源，为后续实验提供了基础。

［1］ 付静静，张玲玲，魏 伟.树突细胞在类风湿性关节炎病理机制中的免疫原性和耐受性双重作用［J］.中国药理学通报，2012，30（9）：1185-8.

［2］ Inaba K，Inaba M，Romani N，et al.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor［J］.J Exp Med，1992，176（6）：1693-702.

［3］ 邓 琼，胡何节，方征东，等.免疫原性和耐受性树突状细胞在粥样硬化动脉壁内的分布及意义［J］.中国动脉硬化杂志，2014，22（6）：567-73.

［4］ Ketelhuth D F，Hansson G K.Cellular immunity，low-density lipoprotein and atherosclerosis：break of tolerance in the artery wall ［J］.Thromb Haemost，2011，106（5）：779-86.

［5］ Fang Z，Deng Q，Hu H，et al.Characteristics of immunogenic and tolerogenic dendritic cells within the arterial wall in atherosclerosis and in vitro［J］.Int J Clin Exp Med，2014，7（12）：4846-56.

［6］ Liu Z D，Wang L，Lu F H，et al.Increased Th17 cell frequency concomitant with decreased Foxp3+Treg cell frequency in the peripheral circulation of patients with carotid artery plaques［J］.Inflamm Res，2012，61（10）：1155-65.

［7］ 刘振明，胡何节，方征东，等.小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建［J］.安徽医科大学学报，2015，50（8）：1177 -80.

Influence of cryopreservation on biological characteristics of mouse bone marrow-derived dendritic cells

Deng Ruqi，Hu Hejie，Fang Zhengdong，et al
（Dept of General Surgery，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

The C57BL/6 mice bone marrow cells were induced and cultivated and cryostoraged at different stages to obtain dendritic cells（DCs）for two groups respectively.The DCs without cryopreservation was control group.We found that no statistical significance of survival rate in anabiotic DCs was between the two groups.There were a higher expression of CD11c and lower expression of CD80，CD86 and major histocompatibility complex class-Ⅱ（MHC-Ⅱ）in three group cells.The mixed lymphocyte reaction and the levels of interleukin-10（IL-10）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）were not statistically significant.We concluded that biological characteristics can be conserved stability in DCs with cryopreservation at different stages.

cryopreservation；dendritic cells；cell culture

R 654.3

A

1000-1492（2016）09-1368-04

时间：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.062.html

2016-04-19接收

安徽省自然科学基金（编号：1408085MH177）

安徽医科大学附属省立医院普通外科，合肥 230001

邓汝淇，男，硕士研究生；胡何节，男，主任医师，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：huhejie@hotmail.com