阿托伐他汀对高糖高脂下系膜细胞的影响

何笑云，欧春麟，肖艳华，周素娴

阿托伐他汀对高糖高脂下系膜细胞的影响

何笑云1，欧春麟2，肖艳华1，周素娴1

探讨阿托伐他汀对高糖高脂环境下人肾小球系膜细胞产生细胞外基质（ECM）及转化生长因子-β1（TGF-β1）的影响。将系膜细胞分为对照组、阿托伐他汀组、高糖高脂组、高糖高脂+阿托伐他汀组，采用实时荧光定量 PCR（qRTPCR）法检测TGF-β1的表达以及用ELISA法检测细胞上清液中IV型胶原（Col IV）和纤维连接蛋白（Fn）的含量。高糖高脂组较对照组TGF-β1 mRNA的表达水平明显增加（P＜0.05），而高糖高脂+阿托伐他汀组较高糖高脂组能明显抑制TGF-β1 mRNA的表达水平（P＜0.05）；高糖高脂组较对照组细胞上清液中ColⅣ、Fn含量明显增加（P＜0.05），而这种作用可被阿托伐他汀所抑制（P＜0.05）。高糖高脂可增加系膜细胞分泌TGF-β1及ECM表达，而阿托伐他汀可逆转这一作用。

阿托伐他汀；高糖高脂；系膜细胞；转化生长因子-β1

1 材料与方法

1.1 材料 逆转录试剂盒（reverse transcription system）（货号：A3500，美国 Promega公司）；SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（货号：RR820A，日本TaKaRa公司）；D-葡萄糖（D-glucose，D-GS）（美国Biomol公司）、溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）（美国Sigma公司）；阿托伐他汀（大连辉瑞制药公司）；Ⅳ型胶原（collagenⅣ，ColⅣ）和纤维连接蛋白（fibronectin，Fn）的ELISA试剂盒（深圳晶美生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 人肾小球系膜细胞为东南大学附属中大医院馈赠，所用培养液为含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，细胞保持在37℃含有5%CO2的潮湿环境中。实验过程共分为四组：①对照组（5.5 mmol/L D-GS）［6-7］；②阿托伐他汀组（10 μmol/L）；③高糖高脂组（30 mmol/L D-GS +20 mg/L LPC）；④ 高糖高脂+阿托伐他汀组（30 mmol/L D-GS+20 mg/L LPC+10 μmol/L阿托伐他汀）。

1.2.2 ELISA法检测细胞上清液中ColⅣ和Fn的含量 收集细胞上清液，参照ELISA试剂盒说明书测定各组ColⅣ与Fn的含量，各组均设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.3 实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法检测TGF-β1 mRNA表达水平 采用TRIzol法提取各组细胞的总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR法检测。引物序列如下：人TGF-β1 mRNA的上游引物：5'-ACTACTACGCCAAGGAGGTCAC-3'，下游引物：5'-TGCTTGAACTTGTCATAGATTTCG-3'；人GAPDH mRNA的上游引物：5'-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3'，下游引物：5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'，引物根据GenBank序列，用软件 Primer Premier 5.0和Oligo 6.22设计，由华大基因生物科技有限公司合成。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复40个循环。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达量。各组均设置3个复孔，实验重复3次。

1.3 统计学处理 使用SPSS 13.0软件进行分析，数据以表示；采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及两两比较的t检验（Student t-test）分析。

表1 阿托伐他汀对高糖高脂下系膜细胞ColⅣ、Fn的影响（）

表1 阿托伐他汀对高糖高脂下系膜细胞ColⅣ、Fn的影响（）

与对照组比较：*P＜0.05；与高糖高脂组比较：#P＜0.05

项目 对照组 阿托伐他汀组 高糖高脂组 高糖高脂+阿托伐他汀组 F值 P值Col IV（μg/L） 4.54±0.74 3.75±0.79 16.32±1.55* 10.80±1.70# 64.75 0.00 Fn（mg/L） 3.90±0.43 3.09±0.67 7.89±0.34* 5.17±0.34# 60.50 0.00

2 结果

2.1 阿托伐他汀对高脂高糖环境下系膜细胞TGF-β1 mRNA表达的影响 与对照组（1.00±0.00）比较，高糖高脂组系膜细胞的TGF-β1 mRNA（1.88± 0.21）表达水平明显上调（P＜0.05），而高糖高脂+阿托伐他汀组（1.43±0.22）相对于高糖高脂组系膜细胞的TGF-β1 mRNA表达水平明显受到抑制（F= 24.62，P＜0.05）。

2.2 高脂高糖环境对系膜细胞ECM分泌的影响收集实验各组的细胞上清液进行ELISA法检测显示，与对照组比较，高糖高脂组系膜细胞的细胞上清液中ColⅣ、Fn含量均升高（P＜0.05）。见表1。

2.3 阿托伐他汀对高脂高糖环镜下系膜细胞ColⅣ、Fn的影响 与高糖高脂组比较，高糖高脂+阿托伐他汀组的细胞上清液中ColⅣ、Fn含量明显受到抑制（P＜0.05）。见表1。阿托伐他汀可抑制高糖高脂刺激引起的ECM相关因子的分泌。

3 讨论

DN是DM的主要微血管并发症之一，常常与DM患者终末期肾脏病密切相关。DN的发生发展与ECM积聚、系膜区的扩张和基底膜的增厚等有关。ColⅣ和Fn作为ECM的重要成分，其过多沉积是诱发各种慢性肾脏疾病（如肾脏进展性纤维化）的病理基础。TGF-β1是目前被认为最重要的促纤维化因子［8］，是TGF-β超家族的成员之一，通常以自分泌、旁分泌两种方式调节细胞的增殖、分化和凋亡等生物功能。TGF-β1与DN的联系密切，在DN肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚及肾小管间质纤维化［9］等中均扮演着重要角色。研究［10］显示，高糖高脂饮食能够促进新西兰兔表达ColⅣ、Fn和TGF-β1等分子，改变其肾小管、间质的结构和功能，促进肾小管间质的纤维化；本研究显示，在高糖高脂环境下，系膜细胞TGF-β1 mRNA的表达较对照组显著增高，细胞上清液中ColⅣ、Fn含量也明显增加。此外，Yang et al［11］研究发现链脲佐菌素大鼠模型的肾皮质TGF-β1表达升高，并且早于ECM扩张；Hwang et al［12］也发现利用shRNA技术沉默TGF-β1的表达后，能够显著地下调Col-Ⅳ以及Fn的表达。可见，TGF-β1与DN发生过程中系膜细胞ECM的分泌密切相关。

阿托伐他汀是临床一线的降脂药物，耐受性极好，且不良反应轻微。该药通过抑制胆固醇与肝脏羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂合成，继而降低血液内的血清脂蛋白及胆固醇浓度。近年来的研究［13-14］显示，阿托伐他汀在调节ECM的异常分泌中也扮演了重要角色，Schierwagen et al［13］研究发现在单关节扎的大鼠模型中，阿托伐他汀能够明显抑制ColⅠ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ的表达从而缓解大鼠的肝纤维化病情；本研究显示，在阿托伐他汀的处理下，可明显降低高糖高脂刺激人肾小球系膜细胞诱导的ColⅣ、Fn的分泌。此外，殷建等［14］对80例糖尿病肾病患者的肾功能相关血清指标进行研究，发现阿托伐他汀治疗组血清中胱抑素C、基质金属蛋白酶抑制剂-1、TGF-β1及ColⅣ等肾纤维化指标的含量明显降低；李成芳［15］对40例早期DN患者分组进行阿托伐他汀治疗，发现阿托伐他汀能通过降低TGF-β1发挥肾脏保护作用。本研究显示，在阿托伐他汀的处理下，可明显降低由高糖高脂刺激人肾小球系膜细胞诱导的TGF-β1表达升高。

综上所述，糖尿病高糖合并脂代谢紊乱的情况下，可诱导系膜细胞TGF-β1的表达以及ECM相关因子（ColⅣ、Fn）的分泌，大大增加了肾小球纤维化的可能性；而阿托伐他汀可明显抑制高糖高脂的这种作用，为DN的治疗提供新的策略。

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Effect of Atorvastatin on the mesangial cells exposed to high glucose and lysophosphatidylcholine

He Xiaoyun1，Ou Chunlin2，Xiao Yanhua1，et al
（1Dept of Endocrinology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001；
2Cancer Research Institute，Central South University，Changsha 410078）

To investigate the effect of Atorvastatin on the role of extracellular matrix（ECM）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）of masangial cells in high glucose and lysophosphatidylcholine（LPC）environment. First，the expression of TGF-β1 was detected by qRT-PCR，then divided the human mesangial cells into four groups：control，Atorvastatin，high glucose and LPC，high glucose and LPC with Atorvastatin.All the groups were cultured for 24 h.Meanwhile，the levels of collagen IV and fibronectin in the supernatant were detected by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Compared with the control group，the expression of TGF-β1 mRNA in high glucose and LPC group was significantly increased（P＜0.05）.However，the expression of TGF-β1 mRNA in high glucose and LPC with Atorvastatin group were significantly decreased compared to high glucose and LPC group（P＜0.05）；Compared with the control group，the level of collagenⅣand fibronectin in the supernatant of high glucose and LPC group was increased significantly（P＜0.05）.However，the effect could be inhibited by Atorvastatin（P＜0.05）.High glucose and LPC can promote the secretion of ECM and the expression of TGF-β1 in mesangial cells，however，the effect can be inhibited by Atorvastatin obviously.

Atorvastatin；high glucose and lysophosphatidylcholine；mesangial cells；transforming growth factorβ1

R 692.6

A

1000-1492（2016）09-1375-03

时间：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.066.html糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一种在糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者临床发病率占20%～40%的代谢紊乱性疾病，常具有进行性肾间质纤维化的特征［1］。阿托伐他汀是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，在降脂、改善内皮功能、抑制细胞外基质（extracellular matrix，ECM）聚集等方面发挥着重要角色［2］。尽管转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）与DN的发生密切相关［3-5］，但在DN发生过程中，阿托伐他汀与TGF-β1的关系尚未明确。该研究通过探讨阿托伐他汀对高糖高脂条件下TGF-β1及ECM的影响，以进一步揭示DN的发病机制。

2016-04-19接收

国家自然科学基金（编号：81260314、81560148）；广西硕士研究生创新项目（编号：YCSZ2015218）

1桂林医学院附属医院内分泌科，桂林 5410012中南大学肿瘤研究所，长沙 410078

何笑云，女，硕士研究生；周素娴，女，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：zoe_ doctor@163.com