miR326调控Ets-1表达及Th17细胞分化参与SLE发病

戴 超，陶金辉，孙晓歌，方 璇，金 莉，项 楠，张 敏，厉小梅，李向培

miR326调控Ets-1表达及Th17细胞分化参与SLE发病

戴 超，陶金辉，孙晓歌，方 璇，金 莉，项 楠，张 敏，厉小梅，李向培

目的 检测系统性红斑狼疮（SLE）患者CD4+T细胞中miR326、E26转录因子-1（Ets-1）表达量及Th17细胞比例，分析三者之间的相关性及与狼疮活动度、系统受累情况的关联，探讨SLE可能的致病机制。方法 选取符合2009年美国风湿病学会诊断标准的SLE患者40例，记录临床资料，选取无自身免疫性疾病的健康志愿者14例。流式细胞术检测 Th17（CD4+IL-17A+）/CD4+T细胞比例，磁珠分选CD4+T细胞、RT-PCR法检测CD4+T细胞中Ets-1 mRNA及miR326的相对表达量。结果 SLE组 CD4+T细胞中miR326水平高于对照组（P=0.003），活动组高于稳定组（P =0.000）；SLE组Ets-1的表达水平低于对照组（P=0.002），活动组低于稳定组（P=0.001）；SLE组Th17细胞比例较对照组增高（P=0.004），活动组高于稳定组，差异有统计学意义；SLE患者miR326表达量与Ets-1表达量呈负相关性（P＜0.001），与Th17细胞比例呈正相关性（P=0.001）；Ets-1与Th17细胞比例呈负相关性（P=0.003）；SLE患者miR326的表达量及Th17细胞比例与SLEDAI评分呈正相关性（P＜0.001），Ets-1与SLEDAI评分呈负相关性（P＜0.001）；SLE患者miR326水平及Th17细胞比例在皮疹、发热、血液系统及肾脏受累的患者中增高，Ets-1的表达量则降低；miR326水平及Th17细胞比例与抗dsDNA、抗核小体呈正相关性，与C3、C4呈负相关性，Ets-1与抗dsDNA、抗核小体呈负相关性，与C3、C4呈正相关性。结论 SLE患者CD4+T细胞中miR326表达明显增高并与Th17细胞比例、疾病活动指标呈正相关性，与Ets-1呈负相关性，提示miR326可能通过抑制Ets-1基因表达，促进Th17细胞分化参与SLE疾病活动。

系统性红斑狼疮；微小RNA；Ets-1；Th17细胞

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种典型的多系统炎症性自身免疫性疾病，以多种自身抗体及免疫复合物引起的组织和器官的损伤为特征，其发病机制尚不完全清楚。Th17（T helper cell 17）细胞是一种以分泌IL-17（interleukin 17）为主的CD4+T细胞亚群。大量实验显示，Th17细胞及其相关细胞因子与SLE的发病以及疾病的活动度密切相关［1］。E26转录因子-1（E26 transformation specific-1，Ets-1）能够调控Th17细胞在内的多种细胞的增殖及分化，进而参与自身免疫性疾病的发生与发展［2］。研究［3］证实Ets-1缺陷鼠的Th细胞比野生型鼠的Th细胞向Th17细胞分化增多，提示Ets-1是Th17细胞分化的负性调节因子，Ets-1缺陷会导致Th17细胞相关应答的异常。miR326是课题组前期运用生物信息学方法筛选出的以Ets-1为靶基因的miRNA，研究［4］表明SLE患者外周单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中Ets-1 mRNA及miR326表达异常，该研究通过检测SLE患者CD4+T细胞中miR326及Ets-1 mRNA的表达水平及Th17细胞比例，分析三者之间的相关性及与狼疮活动程度、系统受累情况及实验室指标的关联，探讨三者在SLE疾病活动中的作用。

1 材料与方法

1.1 病例资料 采用病例对照的研究方法，选取2014年4月～12月于安徽医科大学附属省立医院风湿免疫科住院部及门诊就诊的40例SLE患者，女35例，男5例；年龄18～64（36.00±12.58）岁，所有患者符合美国风湿病学院（ACR）2009年修订的SLE诊断标准。根据SLE疾病活动指数（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）将SLE患者分为活动组（SLEDAI≥5分）21例，稳定组（SLEDAI＜5分）19例。SLE患者的SLEDAI平均评分为（7.65±7.301）分。同时收集SLE患者的详细临床资料，包括肾脏损害、关节痛、皮疹、血液系统受累、发热、雷诺现象等临床表现。14例健康对照者均为健康志愿者，性别、年龄与SLE患者组匹配，无相关免疫性疾病和近期感染史。所有纳入研究的对象根据伦理学要求并签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 流式细胞术荧光抗体抗人CD4-FITC、抗人IL-17A-PE、同型对照抗体、白细胞刺激合剂（美国BD公司）、固定/透膜剂（美国BD公司）；CD4+T细胞磁珠分选试剂盒、LD细胞分选柱（德国MiltenyiBiotec公司）；人淋巴细胞分离液（北京索来宝公司）；TRIzol试剂（美国 Invitrogen公司）；PrimeScript逆转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒、PCR引物（日本TaKaRa公司）。Ets-1引物序列的上游引物：5'-GGAGCAGCCAGTCATCTTTC-3'，下游引物：5'-GTCCCGCACATAGTCCTTGA-3'，预计扩增的产物长度为128 bp；β-actin上游引物：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，预计扩增的产物长度为186 bp。All-in-One miRNA qPCR引物、逆转录试剂盒及PCR试剂盒（美国GeneCopoeia公司）；ABI 7500实时定量PCR仪（美国ABI公司）；BD FACSCantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 流式细胞术 抽取空腹外周静脉肝素钠抗凝血20 ml，分选出PBMCs并行细胞计数。取1× 106个细胞，用1 ml含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬，加入2 μl白细胞刺激合剂，置于37℃、5%CO2培养箱5 h后，取出用PBS重悬，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，用PBS 50 μl重悬，加入10 μl抗CD4-FITC抗体，避光4℃孵育30 min，3 ml PBS重悬后1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入250 μl固定/透膜剂，避光室温孵育20 min，用1 ml现配的Wash液重悬离心弃上清液重复2遍，加入50 μl Wash液及抗IL-17A-PE抗体，避光4℃孵育30 min，1 ml Wash液重悬离心弃上清液重复2遍，100 μl PBS重悬，同时染同型对照，24 h内上机检测。

1.3.2 磁珠分选CD4+T细胞 每107个细胞加入90 μl磁珠分选缓冲液10 μl CD4+T细胞生物素抗体合剂混匀，孵育10 min，每107个细胞再加入20 μl抗生物素抗体磁珠，孵育15 min；每107个细胞加入2 ml缓冲液，1 500 r/min离心10 min后弃上清液；每108个细胞加入500 μl缓冲液重悬细胞，将细胞悬液垂直加入已润洗过的LD柱中，阴选出CD4+T细胞。

1.3.3 RNA提取和cDNA的合成 取分离好的CD4+T细胞，加入500 μl TRIzol，充分混匀后先后加入三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇溶液，最后加入10 μl DEPC水溶解RNA。取2 μl用于RNA浓度和纯度测定，计算逆转所需的RNA体积。利用Prime-Script和All-in-One miRNA逆转录试剂盒分别得到相应的cDNA。Ets-1 mRNA逆转录条件：37℃、15 min，85℃ 5 s。miRNAs逆转录条件：37℃ 60 min，85℃ 5 min，随后将miRNAs逆转录产物稀释5倍。根据SYBR Green PCR和All-in-One miRNA qPCR试剂盒的检测条件，分别扩增Ets-1、miR326及内参基因获得ΔCT值，选择对照组一样本ΔCT值为基准计算ΔΔCT，以2-ΔΔCT值作为各样本相对表达量。1.3.4 实验室指标检测 抗核抗体使用间接免疫荧光法检测，Western blot法检测抗核抗体谱；免疫球蛋白IgG、IgM、IgA及补体C3、C4用免疫比浊法检测，常规检测血、尿常规、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，符合正态分布的计量资料采用t检验，以表示。三组之间的比较使用单因素方差分析及q检验；不符合正态分布的计量资料采用非参秩和检验，以中位数（25分位数，75分位数）［M（P25，P75）］表示，三组间比较使用Kruskal-Willis秩和检验，如差异有统计学意义则进行两两比较，α'修正为0.05/3。双变量符合正态分布的使用Pearson分析相关性，余采用Spearman分析相关性。制图采用 Prism 5.0 （GraphPad）软件。

2 结果

2.1 miR326和Ets-1在CD4+T细胞中的表达水平 SLE组CD4+T细胞中miR326的相对表达量明显高于对照组，差异有统计学意义。采用Kruskal-Willis秩和检验比较三组间差异有统计学意义（χ2= 22.785，P=0.000），进行两两比较，α'修正为0.05/ 3。活动组与对照组比较，差异有统计学意义。活动组与稳定组差异有统计学意义，稳定组与对照组比较，CD4+T细胞中miR326的表达有增高趋势，但差异无统计学意义。

与对照组比较，Ets-1的相对表达量在SLE组明显减低，差异有统计学意义。Kruskal-Willis秩和检验三组间差异有统计学意义（χ2=19.956，P= 0.000），进行两两比较，α'修正为0.05/3。活动组明显低于对照组和稳定组；稳定组与对照组比较，差异无统计学意义。见表1。

2.2 miR326与Ets-1表达及Th17细胞比例的相关分析 SLE组患者外周血中，Th17（CD4+IL-17A+）/CD4+T细胞比例（0.642±0.270）%明显高于对照组（0.407±0.225）%。使用单因素方差分析检验三组，差异有统计学意义（F=16.086，P= 0.000），使用q检验进行两两比较。其中活动组（0.793±0.191）%显著高于对照组和稳定组（0.475 ±0.248）%，差异有统计学意义。稳定组与对照组比较，差异无统计学意义（P=0.367）。分析miR326 与Ets-1、miR326与Th17细胞比例的相关性，结果显示，miR326与Ets-1呈负相关性（r=-0.667，P＜0.001）（图1A）；miR326与Th17细胞比例呈正相关性（r=0.525，P=0.001）（图1B）；Ets-1的相对表达量与Th17细胞的比例呈负相关性（r=-0.465，P =0.003）（图1C）。

表1 SLE患者CD4+T细胞中miR326与Ets-1相对表达量的比较

图1 miR326、Ets-1 mRNA相对表达量及Th17细胞比例之间相关性分析

2.3 SLE患者miR326、Ets-1 mRNA的表达水平及Th17比例与临床特征的分析 将有无关节痛、肾脏受累、皮疹、发热、血液系统受累、雷诺现象等临床表现的SLE患者分为阳性组与阴性组，分别比较两组miR326、Ets-1 mRNA的表达量以及Th17细胞比例有无差异。结果显示，在SLE患者肾脏受累、皮疹、发热及血液系统受累患者中，miR326表达水平增高，Ets-1 mRNA表达水平降低，Th17细胞比例也增高。有无关节痛及雷诺现象组间比较差异无统计学意义。分析SLE患者miR326表达水平与SLEDAI的相关性，结果显示两者呈正相关性（r= 0.531，P＜0.001），Ets-1表达水平与SLEDAI评分呈负相关性（r=-0.536，P＜0.001），Th17/CD4+T细胞比例与 SLEDAI评分呈正相关性（r=0.514，P＜0.001）。见表2。

2.4 SLE患者miR326、Ets-1 mRNA的表达水平及Th17细胞比例与实验室指标的相关分析 结果显示miR326表达水平与抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗核小体抗体、IgG、ESR等指标呈正相关性，与C3、C4呈负相关性；Ets-1 mRNA的表达与抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗核小体抗体呈负相关性，与白细胞、C3、C4呈正相关性；Th17细胞与抗dsDNA、抗RNP、抗核小体抗体呈正相关性，与白细胞、C3、C4呈负相关性。结果显示，SLE活动性指标如抗dsDNA、抗核小体抗体、C3、C4等与miRNA326、Ets-1的表达以及Th17比例明显相关（表3）。与淋巴细胞、血小板、抗核糖体P抗体、Ig、CRP等指标无相关性（P＞0.05）。

表2 SLE患者miR326、Ets-1 mRNA的表达水平及Th17细胞比例与临床特征的比较

3 讨论

microRNA通过与mRNAs结合，在后转录水平调控基因表达。目前发现microRNA参与多种自身免疫疾病的发生。本课题组前期利用生物信息学方法筛选出以Ets-1为靶基因的miRNAs中包括miR326［4］。研究［5］显示多种 microRNA参与调节IL-17细胞因子及其受体的表达。一项系统性硬化症的研究［6］显示miR326能够抑制Ets-1的转录，并且其表达增加与Th17细胞分化增多及疾病活动密切相关，提示miR326可能通过调控Ets-1的表达，影响Th17细胞分化，参与自身免疫炎症反应。本研究仅进行了简单的相关性分析，结果提示miR326与疾病活动相关，但miR326的表达是否受药物如糖皮质激素、免疫抑制剂的影响目前尚不清楚，需要进一步研究。

表3SLE患者miR326、Ets-1 mRNA表达水平及Th17细胞比例与实验室指标的相关性分析

Ets-1是转录因子 Ets家族成员之一，近年的GWAS研究［7］显示 Ets-1是亚洲人SLE的易感基因，并且Ets-1的基因多态性与SLE临床表型有关。既往已有研究［8］表明，SLE患者的PBMCs中Ets-1 mRNA表达水平降低，但尚不清楚SLE患者不同细胞亚群中Ets-1的表达是否存在差异。本研究针对性地检查SLE患者CD4+T细胞亚群中Ets-1 mRNA的表达量，结果进一步证实了SLE患者在特定的T细胞亚群中存在Ets-1的表达缺陷，从而降低了对Th17细胞等免疫炎性细胞的负向调控，导致炎症细胞大量增殖。除了miR326，还有其他microRNA如miR155、miR221、miR222参与 Ets-1的调控，这些microRNA是否与miR326有协同作用，是否也通过调控Ets-1的表达参与SLE的发病都值得进一步探索。

大量的研究［9-10］显示血清中IL-17A的水平及Th17细胞数量与SLE疾病活动有关。并且新发狼疮患者外周血中Th17细胞比例与SLEDAI评分、血清中C3水平和抗dsDNA抗体的水平相关。根据miR326靶向抑制Ets-1的转录，Ets-1缺陷导致Th17细胞分化增多，推测miR326可能通过抑制Ets-1的表达调节Th17细胞分化参与SLE疾病活动。本项研究结果支持上述推测，提示miR326可能通过抑制Ets-1 mRNA的表达水平导致Th17细胞的过度增殖，促进了免疫炎症过程，使SLE疾病活动加剧。本研究仅检测了Ets-1 mRNA的水平，需要进一步进行Western blot实验，从蛋白水平进一步验证。下一步可以通过离体实验、动物实验等选择性的抑制或者促进miR326的表达，再检测Ets-1的表达水平，进一步验证本实验。

综上所述，miR326、Ets-1及Th17细胞在SLE患者CD4+T细胞中表达异常，并且与肾脏受累、皮疹、发热、血液系统受累等以及抗dsDNA抗体滴度增高、补体降低有关，提示在SLE的疾病活动中发挥重要作用。miR326可能通过抑制Ets-1的表达，促进Th17细胞的分化，参与SLE的发病，并可能与临床表型相关。进一步研究miR326与Ets-1是否通过其他可能的作用机制，调节Th17及Treg这两组极性细胞的分化与功能，有助于揭示SLE患者免疫紊乱的具体环节，为临床免疫干预提供新的治疗靶点。

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miR326 participates in SLE morbidity by regulating Ets-1 expression and Th17 cells differentiation

Dai Chao，Tao Jinhui，Sun Xiaoge，et al
（Dept of Rheumatism，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To detect the expression of miR326 and Ets-1 in CD4+T cells and the ratio of Th17 cells of patients with systemic lupus erythematosus（SLE），to analyze their relationship with each other and with the clinical data，to explore the potential pathogenesis of SLE.Methods 40 patients according to 2009 American College of Rheumatology（ACR）SLE diagnosis standards were selected，and recorded their clinical data.14 healthy adults without autoimmune disease were chosen as controls.Flow cytometry was used to inspect the ratio of Th17 cells （CD4+IL-17A+）/CD4+T cells.Magnetic activated cell sorting was used to enrich the CD4+T cells，and reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to inspect the relative expression of miR326 and Ets-1 mRNA in CD4+T cells.Results Compared to the healthy controls，the miR326 expression level in the CD4+T cells of SLE patients was increased obviously（P=0.003），and the expression level was higher in the active group than that in remitting group（P=0.000）.The Ets-1 mRNA expression level in CD4+T cells of SLE group was reduced obviously than that in the controls（P=0.002），and the expression in the active group was lower than that in remitting group（P=0.001）.Compared to the controls，the ratio of Th17 cells/CD4+T cells in SLE group was increased obviously（P=0.004），and significant difference was found between the active group and the remitting group.The miR326 expression had a negative correlation with the Ets-1 expression（P＜0.001）and a positive correlation with the ratio of Th17 cells（P=0.001）.There was also a negative correlation between Ets-1 expression and the ratio of Th17 cells（P=0.003）.The miR326 expression and the ratio of Th17 cells both had a positive correlation with the SLEDAI score，while the Ets-1 expression had a negative correlation with the SLEDAI score.In SLE patients who suffered from erythra，hematologic system or kidney impairment，the miR326 expression and the ratio of Th17 cells increased significantly，while the Ets-1 expression induced compared to the rest SLE patients. The miR326 expression and the ratio of Th17 cells positively regulated with anti-dsDNA antibodies level and antinucleosome antibodies level，and negatively regulated with C3 and C4.On the contrary the Ets-1 expression had a negative regulation with anti-dsDNA antibodies and anti-nucleosome antibodies and a positive regulation with C3 and C4.Conclusion The miR326 expression of CD4+T cells increases obviously in SLE patients and positively correlates to the ratio of Th17 cells and the disease activity index，but has a negative correlation with Ets-1 expression.The results prompt that miR326 could participate in the disease activity of SLE through inhibiting the Ets-1 gene expression and promoting the differentiation of Th17 cells.

systemic lupus erythematosus；miRNAs；Ets-1；Th17 cells

R 593.24.02；R 593.241.02

A

1000-1492（2016）09-1320-05

时间：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.038.html

2016-05-04接收

国家自然科学基金（编号：81373186）

安徽医科大学附属省立医院风湿免疫科，合肥 230001

戴 超，女，硕士研究生； 李向培，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：lixiangpei55@126.com