兔自体富血小板血浆对兔ACL重建后腱骨愈合的影响

李 洋，徐 斌，徐洪港，涂 俊，杨军军

兔自体富血小板血浆对兔ACL重建后腱骨愈合的影响

李 洋，徐 斌，徐洪港，涂 俊，杨军军

目的 探讨兔自体富血小板血浆（PRP）对前交叉韧带（ACL）重建后腱骨愈合的作用。方法 选取30只新西兰大白兔，兔龄体重相仿，随机均分为实验组和对照组。实验组每只抽取自体全血，二次离心法获得PRP。实验组移植入PRP和生物蛋白凝胶复合物；对照组移植入生物蛋白凝胶。分别于4、8、12周3个时间点处死5只兔子取材，3只用于骨道内移植物抗拉力试验，采用独立样本t检验比较；2只用于观察形态学，对上述3个时间点的两组标本分别行腱骨界面Buark评分，采用Wilcoxon秩和检验，观察ACL重建术后腱骨愈合的情况。结果 Masson三色染色显示实验组术后8周前胶原纤维增生不明显，排列混乱，8周后开始到12周胶原纤维开始大量增生，排列逐渐有序；而对照组8周及12周只见到少量排列无序的胶原纤维。移植物抗牵拉实验显示实验组和对照组的股骨道移植物抗牵拉强度与时间长度呈正比，由8周开始PRP组明显强于对照组（P＜0.01）。结论 PRP对腱骨界面胶原纤维形成以及生物力学强度有促进作用。

前交叉韧带；富血小板血浆；腱骨愈合

随着全民健身的普及和各种意外事故的频繁发生，涉及膝关节前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）的运动损伤越来越常见，人们对于运动损伤，特别膝关节韧带损伤的认识也在逐渐加深，进一步治疗的需求也在不断加强，膝关节ACL损伤后的治疗面临着极大的考验。膝关节是全身中结构最复杂的关节，同时也是受杠杆作用最强以及损伤最多的关节［1］。膝关节的交叉韧带是稳定膝关节的重要结构，一旦交叉韧带出现损伤，膝关节的各种问题（包括关节不稳定、半月板损伤、骨性关节炎等）可能会接踵而至，短期内膝关节会丧失稳定性，个体会暂时失去一些基本的行走跑跳功能，膝关节就不能满足日常生活和运动的需求，长期来说就会给膝关节造成完全不可逆的破坏，所以ACL损伤的修复重建一直是骨科和运动创伤领域重要的研究方向之一［2］。随着关节镜微创技术的不断发展，膝关节镜下ACL重建技术日趋成熟，但是对于重建后，腱骨愈合所能达到的程度依然是研究的热点［3］。关于移植物在骨道内愈合因素的研究包括物理机械干扰、生物因素刺激、干细胞移植和富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）及其生长因子等多个方面［4］。该研究探讨PRP对ACL重建术后腱骨愈合是否有促进作用。

1 材料与方法

1.1 PRP的提取与鉴定 本实验所使用是国际上较公认的Landesberg法［5］，取实验组动物的全血8 ml于离心管中，以1 400 r/min离心10 min，吸取全部的上清液达交界平面下3 mm，将吸取液移入另一无菌离心管中，再以1 400 r/min离心10 min，吸弃上清液，留适量血浆以容纳并稀释高浓度的血小板。

1.2 动物模型的建立 于安徽医科大学实验动物中心分批购买30只新西兰大白兔，兔龄3～4个月，按实验要求随机分为PRP组和对照组，每组15只，所有实验动物取右后肢行ACL重建术。造模：麻醉后备皮，碘酒消毒后铺巾，小腿后方酒精擦皮后作纵行切口，逐层分离取适合长度的趾长屈肌腱，关闭取腱口。将肌腱对折，使用4-0无菌缝合线缝合游离端，另一端用1.0 mm钢丝穿过，移植肌腱用无菌生理盐水纱布包裹备用。以髌骨为中心，沿膝关节内侧髌旁入路，依次切开皮肤、筋膜及内侧支持带，将髌骨外置做脱位状态，充分暴露膝关节腔，剪断ACL，建立ACL损伤模型后，检查前抽屉试验及拉赫曼实验均显示阳性结果。将兔膝关节置于90°，沿原ACL股骨及胫骨止点处，使用2.5 mm克氏针建立胫骨与股骨隧道，于股骨髁上方约1.5 mm处由1.0 mm克氏针建立两处骨道，用于肌腱股骨端钢丝固定，自胫骨端向股骨端穿钢丝引入移植肌腱，股骨端由钢丝穿过预留的1.0 mm股骨骨道，达于内侧螺旋拧紧固定，将PRP凝胶均匀注入实验组兔子的股骨隧道，对照组兔子的股骨隧道仅注入单纯凝胶，胫骨端肌腱拉紧并与周围软组织紧密缝合固定。复位髌骨，再次检查前抽屉试验及拉赫曼试验，结果阴性。无菌生理盐水冲洗关节腔，逐层缝合，无菌敷料包扎，右膝关节30°长腿石膏固定两周。待苏醒后送回安徽医科大学动物饲养中心，实验动物于术后抗生素肌注3 d以预防感染，每日观察实验动物的术后情况，实验动物伤口未见红肿等感染，存活至标本取材阶段。

1.3 标本的制备及组织学观察 在术后第4、8、12周每组各处死5只实验动物，去除肌肉等软组织，保留完整韧带结构的右膝关节，其中3只用于股骨端移植物抗牵拉力试验，2只用于Masson三色染色。将用于染色的完整膝关节使用10%中性福尔马林溶液固定72 h，后于10%EDTA磷酸缓冲液脱钙4～6周，用石蜡仪制成石蜡切片，Masson染色后作形态学观察。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行分析，数据以表示，Buark评分数据采用有序分类两组独立样本的Wilcoxon秩和检验，两组间采用两样本t检验。

2 结果

2.1 组织标本观察

2.1.1 膝关节标本的观察 PRP组及对照组4周时间点标本关节腔可见血性积液，未见胶体残存，可见滑膜大量增生，软骨无明显破坏，移植肌腱走形正常，张力可，不松弛、无断裂。8周及12周时间点PRP组及对照组膝关节积液量明显减少，PRP组可见大量滑膜组织，对照组滑膜组织较PRP组略少，两组的骨髓道外口均出现类骨样组织，内口可见瘢痕组织。

2.1.2 Masson三色染色观察 术后4周：对照组仍可见大量坏死组织，只有少量成纤维细胞出现，无明显胶原纤维生成，并且纤维排列错乱。PRP组坏死组织相对较少，可见少量成纤维细胞，开始见胶原纤维长入，组织排列仍然无序。术后8周：对照组可见大量成纤维细胞，腱骨愈合界面有少量胶原纤维长入，纤维排列依然欠规则。PRP组可见大量成纤维细胞，腱骨愈合界面有大量胶原纤维长入，大部分纤维开始呈现整齐有序排列，但仍有少量纤维无序生长。术后12周：对照组成纤维细胞数量变少，而胶原纤维生成增多，成纤维细胞与胶原纤维于腱骨愈合交界处分布相仿。PRP组成纤维细胞数量明显减少，仅残余少量成纤维细胞，腱骨愈合交界处可见大量胶原纤维规则排列。见图1。

图1 不同时间点腱骨界面Masson三色染色 ×100

2.2 两组标本的Buark评分 依据实验动物标本腱骨界面的组织形态学，测量腱骨界面一定长度中Sharpey纤维占有页面的百分比以及腱骨界面的纤维血管组织的分布情况。Buark评分有以下4层标准：① Grade I缺乏组织结构的疏松纤维血管组织界面；②Grade II已机化的纤维血管组织伴有胶原纤维产生，占有的界面长度＜30%；③Grade III成熟的纤维组织，细胞和血管减少，占有的界面长度30%～60%；④ Grade IV纤维血管组织机化成致密结缔组织，垂直于骨道方向的Sharpey纤维占有的界面长度＞60%。12周内PRP组与对照组组织形态学Buark评分差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 股骨道移植物抗牵拉试验 如图2所示将预处理好的离体膝关节固定于测试架上，股骨和胫骨分别固定于测试架上方和下方，保持膝关节90°位，将合适大小的铝板贴附于胫骨结节后方，并用钢丝固定，连接至拉力计，先用4 N拉力预张移植物，再均匀施加牵拉力，直至使移植物由骨道内脱出，记录此时的拉力数值。详细记录两组肌腱脱出骨道内时拉力的大小。实验组和对照组的股骨道移植物抗牵拉强度与时间长度呈正比，由8周开始PRP组明显强于对照组（P＜0.01）。见表2。

表1 两组标本的组织形态学Buark评分

图2 股骨道移植物抗牵拉强度试验

表2 术后3个时间段两组移植物股骨道内抗牵拉强度数据对比（单位：N）

3 讨论

中国每年每10万人中就有38例ACL损伤的患者［5］，运动员中比例更高，每年接受韧带重建的手术患者也在逐渐增多，运动医学也越来越受到大家的重视。随着技术的不断进步和手术器械的研制创新，关节镜下ACL重建手术已经成为现代治疗膝关节交叉韧带损伤的主流方法［6］。关节镜下重建ACL有疗效确切、创伤小、恢复快以及并发症少等优点［7］，但是术后移植物如何更好地融入患者的膝关节，如何最大程度的替代ACL的功能依然是研究的热点［8］。

Friedman在1988年最早描述关节镜下采用自体半腱肌肌腱重建ACL［6］。从此开始了对ACL重建手术的研究。从选择自体半腱肌肌腱到自体腘绳肌肌腱的单股，再到后来的自体半腱肌肌腱联合自体股薄肌肌腱的四股。由自体移植物到异体移植物的选择，再到近年来出现的人工韧带，还有固定技术、导航技术也日新月异、日趋成熟［9］。随着科技的进一步发展，研究开始向细胞水平转移，PRP是富含血小板的血浆，通过血小板里的α颗粒释放的生长因子和细胞因子可以促进移植物的成熟。有研究［10］表明，在ACL移植物成熟过程中，PRP可以增强细胞活力，促进胶原蛋白（Ⅰ型和Ⅲ型）的表达。PRP可以在一个较早时间点内促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成和腱骨愈合。最近，在一些ACL重建手术中，PRP已经被用来加速移植肌腱的成熟过程［5，11］。然而，PRP对肌腱移植物重塑过程中ECM的合成与降解的影响并不十分清楚［12］。PRP含有与创伤愈合、骨再生相关等多种生长因子，如转化生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样因子、血管内皮生长因子和表皮生长因子［3，13］。PRP在局部组织的修复中发挥着重要作用，其具有的高效诱导活性，且又不易引起免疫排斥反应，可以释放大量细胞因子及生长因子，大幅度提高细胞的增殖分化能力，并促进各种ECM的合成，加快加强腱骨愈合的进程［14］。以上形态学实验显示4～8周后PRP组坏死组织明显减少，大量成纤维细胞及胶原纤维长入，排列规则、整齐，明显好于对照组；股骨骨道内移植物抗拉力试验同样显示PRP组强度要明显强于对照组。

ACL重建技术已经十分成熟，但是重建后移植物腱骨愈合的好坏、功能恢复的快慢依然是研究的热点。PRP的众多优点也决定着其拥有广阔的前景。本实验以组织形态学以及生物力学两个方面同时证实了PRP在移植物重建后对腱骨愈合确实有促进作用，但是因PRP本身的复杂性，具有多种丰富的生长因子，本实验未能进一步探索各个因子之间的相互作用关系，希望远期研究可以进一步发现PRP中各个因子的单独作用，使PRP得到更好的应用前景。

［1］ 张红宇，赵卫东.磁共振成像对膝关节骨挫伤的诊断价值［J］.山西医药杂志，2008，37（11）：976-7.

［2］ 王永健，敖英芳.自体半腱肌重建兔前交叉韧带腱骨愈合和止点形成试验研究［J］.中国运动医学杂志，2007，26（1）：5-9.

［3］ 翟文亮，陈界文，练克俭，等.富血小板血浆复合物促进兔前交叉韧带重建后腱骨愈合的组织学研究［J］.中华创伤骨科杂志，2011，13（9）：861-6.

［4］ Figueroa D，Figueroa F，Calvo R，et al.Platelet-rich plasma use in anterior cruciate ligament surgery：systematic review of the literature［J］.Arthroscopy，2015，31（5）：981-8.

［5］ 左 健，孙 皓，潘 乐.同种异体肌腱移植物重建前交叉韧带的免疫排斥反应［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15 （53）：10039-42.

［6］ 乔绍文，武永刚.关节镜下前交叉韧带重建术研究进展［J］.包头医学院学报，2009，25（1）：116-8.

［7］ Bissell L，Tibrewal S，Sahni V，et al.Growth factors and platelet rich plasma in anterior cruciate ligament current reconstruction［J］. Curr Stem Cell Res Ther，2014，10（1）：19-25.

［8］ Andia I，Maffulli N.Use of platelet-rich plasma for patellar tendon and medial collateral ligament injuries：best current clinical practice［J］.J Knee Surg，2015，28（1）：11-8.

［9］ Sakata R，McNary S M，Miyatake K，et al.Stimulation of the superficial zone protein and lubrication in the articular cartilage by human platelet-rich plasma［J］.Am J Sports Med，2015，43（6）：1467 -73.

［10］Xie X，Wu H，Zhao S，et al.The effect of platelet-rich plasma on patterns of gene expression in a dog model of anterior cruciate ligament reconstruction［J］.J Surg Res，2013，180（1）：80-8.

［11］Silva A，Sampaio R.Anatomic ACL reconstruction：does the platelet-rich plasma accelerate tendon healing［J］.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2009，17（6）：676-82.

［12］Cheng M，Johnson V M，Murray M M.The Effects of age and platelet-rich plasma on ACL cell viability and collagen gene expression［J］.J Orthop Res，2012，30（1）：79-85.

［13］ Karaoglu S，Uluoz M，Yazici C，et al.The Effects of platelet rich plasma（PRP）on tendon-to-bone tunnel healing in a rabbit model ［J］.Arthrosc，2011，27（10）：e124-5.

［14］曹 文，姚光慧，陈玉华，等.富血小板血浆体外培养骨髓间充质干细胞的增殖与胶原产生［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010（45）：8373-6.

Effect of platelet rich plasma on the healing of tendon bone after reconstruction of rabbit ACL

Li Yang，Xu Bin，Xu Honggang，et al
（Dept of Sports Injury and Arthroscopic Surgery，
The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the effect of autologous platelet rich plasma（PRP）in tendon bone healing after reconstruction of the anterior cruciate ligament（ACL）.Methods 30 New Zealand rabbits were randomly divided into the experimental group and the control group（n=15 per group）.In the experimental group the platelet rich plasma was obtained by the method of two-step centrifugation，and the experimental group was implanted with PRP and fibrin gel and the control group received gel only.The 5 rabbits in each group were retrieved at 4th，8th and 12th week，All animals for gross observation at first，then three rabbits were used for biomechanical testing，Two rabbits for the pathological observation，the staining results were scored using the BUARK.Results 8 weeks after operation，the collagen fiber hyperplasia was not obvious in the experimental group，and the arrangement was in disorder.From the 8th week to the 12th week of the experimental group，the collagen fibers began to proliferate，the arrangement became more ordered.In the control group，only a small amount of collagen fibers were found in the 8th and 12th week.In the experimental group and the control group，the maximum biomechanical pull-out strength of the autograft in the femur tunnel was proportional to the repair time，and the experimental group was significantly stronger than that in the control group at the beginning of 8th weeks（P＜0.01）.Conclusion PRP can promote the formation of collagen fibers and the mechanical strength of the tendon bone interface.

anterior cruciate ligament；platelet rich plasma；tendon bone healing

R 686.5

A

1000-1492（2016）09-1277-04

时间：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.020.html

2016-05-04接收

安徽省自然科学基金（编号：1208085MH157）

安徽医科大学第一附属医院运动创伤与关节镜外科，合肥230032

李 洋，男，硕士研究生；徐 斌，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：youchen100@126.com