白肋烟烟叶含水率与高温贮藏过程中TSNA形成的关系

孙榅淑，王俊，许东亚，周骏，白若石，马雁军，杨惠娟，焦哲恒，史宏志

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，河南 郑州 450002；2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京 100024

农艺与调制

白肋烟烟叶含水率与高温贮藏过程中TSNA形成的关系

孙榅淑1，王俊1，许东亚1，周骏2，白若石2，马雁军2，杨惠娟1，焦哲恒1，史宏志1

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，河南 郑州 450002；2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京 100024

对不同含水率的白肋烟烟叶进行高温贮藏试验，并分别向高含水率和低含水率烟叶添加硝酸盐和亚硝酸盐后高温贮藏，测定贮藏前后烟叶的TSNA含量。结果表明：1）经45℃高温贮藏15 d后，含水率越高的烟叶，TSNA含量越低，含水率超过17.5%后趋于稳定。2）细化梯度试验中，低含水率烟叶经45℃高温贮藏15 d后，随着烟叶含水率从7.7%增加到15.3%，四种TSNA含量和TSNA总量逐渐降低，烟叶含水率高于15.3%后，TSNA总量趋于稳定。3）添加亚硝酸盐再经60℃高温贮藏15 d的高含水率烟叶和低含水率烟叶TSNA含量均大幅度增加，而添加硝酸盐的高含水率烟叶处理TSNA含量增幅较小，低含水率烟叶处理TSNA含量增幅很大，所以低含水率烟叶硝态氮比高含水率烟叶硝态氮更易生成亚硝酸等氮氧化物是造成高温贮藏过程中TSNAs大量形成的主要原因。研究认为，在保证烟叶不霉变的前提下适当增加贮藏湿度有利于减少贮藏过程TSNAs的形成。

白肋烟；含水率；贮藏；TSNAs

烟草特有亚硝胺(tobacco-speci fi c nitrosamines,TSNAs)是烟草生物碱和亚硝酸发生亚硝化反应生成的存在于烟叶和烟气中的有害化合物[1-2]。主要有N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-甲基-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)等4种[3]。许多研究表明，调制前的烟叶不含TSNAs或含量极低[4-5]，烟叶中的TSNAs主要在调制和贮藏过程中形成和积累，但目前研究多集中在烟叶调制期间TSNAs的形成。在调制阶段，较高的湿度、适宜的温度及缺氧等条件能促进微生物的生长和繁殖，微生物的活动可使烟叶中的硝酸盐还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐与烟草生物碱反应形成TSNAs[6]。白肋烟调制后的贮藏阶段也是TSNA形成的重要时期，温度和湿度是贮藏环境的两个主要因素。前期研究结果表明，随着温度的增加，白肋烟在贮藏阶段TSNA含量大幅度增加[7-8]。Bush等[9]研究发现，贮藏过程中湿度对TSNA形成的影响与烟叶调制过程中湿度的影响截然不同，在贮藏过程中，烟叶TSNA含量在含水量7%～11%的干燥情况下增加最多，烟叶含水量大于20%时TSNA含量几乎没有增加。国内白肋烟打叶复烤后烟叶含水率约15%～17%，一般要在库房中经过2.5～3年的自然陈化，因此环境温度和湿度对烟叶贮藏条件影响很大，夏季高温季节贮藏温度可达45℃以上，干旱季节烟叶含水率可在10%以下，贮藏环境可直接影响烟叶TSNAs的形成。为了进一步研究烟叶含水率对高温贮藏过程中TSNA形成的影响和机理，设置不同含水率烟叶的高温贮藏试验，以明确可以有效降低TSNA含量的烟叶含水率参数。在另一个试验中，分别向低含水率烟叶和高含水率烟叶人为添加硝酸盐和亚硝酸盐，得到了硝酸盐、亚硝酸盐含量较高的烟叶，并进行高温贮藏，探讨不同含水率烟叶在分别添加硝酸盐和亚硝酸盐后TSNA增加的效应。该研究旨在揭示贮藏过程中烟草特有亚硝胺的形成机理，可为减少贮藏阶段TSNA形成提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为白肋烟中部叶，烟叶品种为TN86，试验1所用烟叶于2012年在云南云龙种植，试验2所用烟叶于2012年在云南宾川种植，试验3所用烟叶于2013年在云南宾川种植，调制方法均为晾房晾制。将烟叶去除主脉后，剪成0.5 cm2大小的碎片，充分混匀放入冰箱待用。

1.2 试验方法

1.2.1 对贮藏前的烟叶取样

以下每个试验进行之前，均取20 g烟叶样品，冷冻干燥后磨碎，过60目筛，测定样品高温贮藏前的TSNA含量。

1.2.2 不同含水率烟叶（试验1）

基于在一定温度下密闭空间内的饱和盐溶液能使空气湿度恒定的特性，试验中空气湿度通过装有饱和盐溶液的密封干燥皿来控制。在24.5℃的密闭环境中，饱和K2CO3溶液能使空气湿度保持在43%，通过控制其浓度来调节空气湿度。烟叶含水率试验设5个处理，在5个干燥皿中分别加入饱和K2CO3溶液、3/4饱和K2CO3溶液、1/2饱和K2CO3溶液、1/4饱和K2CO3溶液、蒸馏水各300 mL，每个处理称20 g烟叶用报纸包起来放在干燥皿的瓷板上，密封干燥皿。将干燥皿置于24.5℃培养箱中处理4 d后测得烟叶相对含水率分别为7.71%、11.23%、17.53%、25.12%、31.52%。然后将含水率恒定的烟叶分别转移至玻璃闪烁计数瓶中置于45℃培养箱贮藏15 d。每一处理设3次重复。

1.2.3 细化梯度的低含水率烟叶（试验2）

由于含水率高的烟叶不宜长期贮存，进一步细化湿度梯度，设6个处理，溶液分别为饱和K2CO3溶液、9/10饱和K2CO3溶液、8/10饱和K2CO3溶液、7/10饱和K2CO3溶液、6/10饱和K2CO3溶液、1/2饱和K2CO3溶液各300 mL，其它方法同上，将干燥皿置于24.5℃培养箱中处理4 d后烟叶相对含水率分别为7.71%、8.90%、9.93%、12.30%、15.30%、17.53%。将含水率恒定的烟叶分别转移至玻璃闪烁计数瓶中，置于45℃培养箱贮藏15 d。每一处理设3次重复。

1.2.4 低含水率烟叶和高含水率烟叶人为添加硝酸盐和亚硝酸盐（试验3）

低含水率烟叶中添加硝酸盐和亚硝酸盐试验设3个处理，每个处理20 g烟叶，处理1喷10 mL清水，处理2将1 g NaNO3溶解于10 mL清水中喷在烟叶上，处理3将0.1 g NaNO2溶解于10 mL清水中喷在烟叶上。喷过清水和盐溶液的各处理烟叶含水率较高，晾于15℃，相对湿度为60%的环境中12 h后烟叶含水率有所降低，用饱和K2CO3溶液平衡水分4 d后烟叶的相对含水率为7.71%。高含水率烟叶中添加硝酸盐和亚硝酸盐试验设3个处理，方法同上，处理后烟叶用1/2饱和K2CO3溶液平衡水分4天后烟叶的相对含水率为17.53%。6个处理烟叶分别转移至玻璃闪烁计数瓶中置于60℃培养箱贮藏15 d。

将所有样品冷冻干燥，磨碎后过60目筛。每个处理设3次重复。

1.3 TSNA含量测定

所有样品均送至上海烟草集团北京卷烟厂进行测定，应用在线SPE-液相色谱质谱联用（SPE-LC-MS/MS）法[10]，即将烟样全自动固相萃取，萃取液过水相滤膜后使用LC-MS/MS进行检测。

2 结果与分析

2.1 烟叶含水率对白肋烟高温贮藏过程TSNA形成的影响

由表1结果可知，高温贮藏后各处理烟叶的4种TSNA含量及TSNA总量远高于贮藏前。高温贮藏的不同处理间TSNA总量存在较大差异，烟叶含水率为7.71%时TSNA总量最高，随着烟叶含水率的增大，白肋烟贮藏过程TSNA总量逐渐下降，烟叶含水率增大到17.53%后再继续增大，TSNA总量趋于稳定，降低幅度较小。除了含水率为25.12%和31.52%的两处理之间差异不显著外，其它处理之间均有显著差异。

高温贮藏条件下含水率为7.71%的处理NNN、NAT、NNK的含量均最高，且随着烟叶含水率的增大而逐渐降低，增大到17.53%后再继续增大，3种TSNA含量降低幅度减小或不再降低。不同含水率的烟叶NAB含量存在较大差异，烟叶含水率为11.23%时NAB含量最高，为25.12%时NAB含量最低，无明显规律。

表1 不同含水率白肋烟45℃贮藏15 d后的TSNA含量Tab.1 TSNA contents in burley tobacco leaves with different moisture content after 45℃ storage for 15 d μg·g-1

2.2 细化梯度的烟叶含水率对白肋烟高温贮藏过程TSNA形成的影响

高温贮藏前未平衡水分的烟叶含水率为13.60%，其NNN、NAT、NAB、NNK的含量分别为0.5649，0.5969，0.0111，0.0354，TSNA总量为1.2083。图1和图2为细化含水率梯度的白肋烟45℃高温贮藏15 d后的TSNA含量。高温条件下贮藏的不同含水率的烟叶TSNA含量均显著高于贮藏前，这和前期研究的温度对白肋烟贮藏过程中TSNA形成的影响的结果一致。在同样的高温贮藏条件下，随着烟叶含水率从7.71%增加到15.30%，4种TSNA含量及TSNA总量逐渐降低。当烟叶含水率高于15.30%时，TSNA总量趋于稳定。

图1 细化含水率梯度的白肋烟45℃贮藏15 d后TSNA含量Fig. 1 TSNA contents in burley tobacco leaves with detailed gradient moisture content after 45℃ storage for 15 d

图2 细化含水率梯度的白肋烟45℃贮藏15 d后TSNA总量Fig. 2 Total TSNA content in burley tobacco leaves with detailed gradient moisture content after 45℃ storage for 15 d

2.3 不同含水率烟叶中添加硝酸盐和亚硝酸盐对其高温贮藏过程中TSNA形成的影响

高温贮藏前烟叶的含水率为13.60%，其NNN、NAT、NAB、NNK含量及TSNA总量的测定结果分 别 为 0.9835，1.7329，0.0338，0.0661，2.8163。60℃高温贮藏15 d后各处理烟叶的4种TSNA含量及TSNA总量如图3～图4所示。高温贮藏后喷清水对照烟叶的TSNA含量是贮藏前的数十倍，低含水率对照烟叶TSNA总量是高含水率对照烟叶的2.32倍。高温贮藏后，喷硝酸盐的高含水率烟叶TSNA含量与喷清水对照相比有少量增加，喷亚硝酸盐的烟叶TSNA含量大幅度增加。低含水率烟叶喷硝酸盐的效果与高含水率烟叶不同，4种TSNA含量和TSNA总量大幅度增加，喷亚硝酸盐的烟叶TSNA含量与喷清水对照相比的增加量大于喷硝酸盐的增加量。

图3 喷施硝酸盐和亚硝酸盐的不同含水率烟叶60℃贮藏15 d后4种TSNA含量Fig. 3 TSNA contents in burley tobacco leaves added with nitrate and nitrite at different moisture contents after 60℃ storage for 15 d

图4 喷施硝酸盐和亚硝酸盐的不同含水率烟叶60℃贮藏15 d后TSNA总量Fig. 4 Total TSNA content in burley tobacco leaves added with nitrate and nitrite at different moisture contents after 60℃ storage for 15 d

3 讨论

试验结果表明，45℃高温贮藏后烟叶中TSNA含量均远高于贮藏前，随着含水率的增加，烟叶TSNA增加量减小。烟叶含水率增大到17.5%后再继续增大，TSNA总量趋于稳定，这和Bush研究的结果一致。在45℃的高温贮藏条件下，进行细化含水率梯度试验，随着烟叶含水率从7.7%增加到15.3%，4种TSNA含量和TSNA总量的增加量逐渐降低。高含水率和低含水率的白肋烟中人为添加亚硝酸盐并于60℃高温贮藏15 d后TSNA含量均大幅度增加。高含水率的白肋烟人为添加硝酸盐后，60℃高温贮藏过程TSNA含量有少量的增加，而低含水率的白肋烟人为添加硝酸盐后，高温贮藏过程TSNA含量大幅度增加。这可能是由于在高湿条件下硝酸盐是水溶态的，而在低湿条件下硝酸盐更利于挥发出气体氮氧化物[11-12]，与生物碱生成烟草特有亚硝胺。Shi等[8]和Verrier等[13]研究表明，在一定湿度条件下，随着贮藏温度的升高，烟叶TSNA含量显著升高，特别是贮藏温度超过27℃时更甚。因此，烟叶含水率控制在17%以上，贮藏温度控制在27℃以下的低温高湿贮藏可有效减少贮藏过程TSNA形成。在生产上贮藏温度过低会使烟叶发酵不充分，而贮藏湿度过高烟叶霉菌繁殖快，易于霉变，且贮藏过程中容易细胞破裂而“出油”，粘结成块，氧化变黑，会影响烟叶的外观质量和感官质量[5]。因此在控制烟叶含水率保证烟叶不发生霉变，温度能保障烟叶正常发酵的前提下，适当降低贮藏温度，增大烟叶含水率可以有效地降低白肋烟贮藏过程中TSNAs的积累。

4 结论

在高温贮藏条件下，烟叶含水率对贮藏过程中TSNA形成有重要影响。高温贮藏后烟叶中TSNA含量远高于贮藏前，含水率高的烟叶TSNA增加量相对较小。低含水率烟叶硝态氮比高含水率烟叶硝态氮更易生成亚硝酸等氮氧化物是造成高温贮藏过程中TSNAs大量形成的主要原因。

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The relationship between moisture content and TSNA formation in burley tobacco during high temperature storage

SUN Wenshu1, WANG Jun1, XU Dongya1, ZHOU Jun2, BAI Ruoshi2, MA Yanjun2, YANG Huijuan1, JIAO Zheheng1, SHI Hongzhi1
1 National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Tobacco Cultivation Key Laboratory of China Tobacco, Zhengzhou 450002, China;2 Beijing Cigarette Factory, Beijing 100024, China

Burley tobacco leaves with varied moisture content levels were stored at high temperature environment. Burley tobacco leaves with high and low moisture content were stored at high temperature environment after adding nitrate and nitrite separately. All samples before and after high temperature storage were measured for TSNAs. Results indicated that the TSNA contents decreased with the increment of moisture content after 45℃ storage for 15 d. While moisture content was higher than 17.5%, the total TSNA content tended to be stable. After 45℃ storage for 15 d, four individual TSNA content and the total TSNA content in burley tobacco with detailed moisture content decreased as the moisture content increased from 7.7% to 15.3%. While the moisture content was higher than 15.3%, the total TSNA content tended to be stable. After 60℃ storage for 15 d, nitrite sprays caused a very marked increase of TSNA contents in both the low and high moisture tobaccos, nevertheless, nitrate sprays caused a much smaller increase of TSNA contents in the high moisture tobacco but a signi fi cant increase in the low moisture tobacco. Nitrate more easily produced nitrite and other gaseous NOx in low moisture tobacco than high moisture tobacco during high temperature storage was the main reason for increased TSNA formation. Proper increase of the moisture content of cured tobacco would be e ff ective pathways to reduce TSNA formation during high temperature storage.

burley tobacco; leaf moisture; storage; TSNAs

孙榅淑，王俊，许东亚，等. 白肋烟烟叶含水率与高温贮藏过程中TSNA形成的关系 [J]. 中国烟草学报，2016,22（4）

国家烟草专卖局减害重大专项项目：110201301022（JH-03）

孙榅淑（1990—），在读硕士研究生，主要从事烟草栽培生理研究, Email：swssdd123@163.com

史宏志（1963—），博士，教授，博士生导师，主要从事烟草栽培生理研究，Email: shihongzhi88@163.com

2015-07-06

:SUN Wenshu, WANG Jun, XU Dongya, et al. The relationship between moisture content and TSNA formation in burley tobacco during high temperature storage [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)