IgA/ EBV-VCA阳性人群和鼻咽癌患者的EB病毒潜伏膜蛋白2特异性细胞免疫及EBV DNA载量检测

谭珍连 王勇利 麦稚平 廖建 王湛 詹少兵 杜海军

643200 广西梧州市疾病预防控制中心(谭珍连)；广西自治区人民医院(王勇利)；643200 广西苍梧鼻咽癌防治所(麦稚平、廖建);102206 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(王湛、詹少兵、杜海军)



·技术方法·

IgA/ EBV-VCA阳性人群和鼻咽癌患者的EB病毒潜伏膜蛋白2特异性细胞免疫及EBV DNA载量检测

谭珍连 王勇利 麦稚平 廖建 王湛 詹少兵 杜海军

643200 广西梧州市疾病预防控制中心(谭珍连)；广西自治区人民医院(王勇利)；643200 广西苍梧鼻咽癌防治所(麦稚平、廖建);102206 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(王湛、詹少兵、杜海军)

目的 探讨IgA/VCA抗体滴度与EBV LMP2特异性细胞免疫水平和EBV DNA拷贝数关系。方法 免疫酶法检测普查样本IgA/VCA抗体滴度；选取IgA/VCA抗体阳性人群和治疗前鼻咽癌患者，通过γ-干扰素Elispot和EBV DNA荧光定量试剂盒检测LMP2特异性细胞免疫水平和血浆中的EBV DNA载量。结果 普查广西苍梧县城自然人群共1 233人,其中80人IgA/VCA抗体阳性，阳性率为6.0%。对其中的72例IgA/VCA抗体阳性人群和20未治疗的鼻咽癌患者进行了LMP2 特异性细胞免疫和EBV DNA检测，随着抗体滴度的升高，LMP2 特异性细胞免疫反应水平降低，而血浆中EBV DNA拷贝数有随IgA/VCA抗体滴度升高而增加的趋势。 结论 EBV-LMP2特异性细胞免疫水平和EBV DNA拷贝数可能与IgA/VCA抗体滴度相关。

Fundprograms:NationalBasicResearchProgramofChina(2011CB504800);NationalHigh-techR&DProgramofChina(2012AA02A404);BeijingKeyLaboratoryofEnvironmentalandViralOncology(EV02012021)

EB病毒病毒壳抗原IgA(IgA/VCA)抗体水平可以作为鼻咽癌早期筛的一个重要指标，随着抗体滴度的上升，发展成鼻咽癌的风险大大增加[1, 2]。我们以前的研究结果表明在健康人、IgA/VCA阳性人群和鼻咽癌患者中特异性细胞免疫水平逐渐降低[3]，在鼻咽癌患者中随着病情的发展而患者血浆中EBVDNA的拷贝数逐渐增加[4]。而在IgA/VCA不同抗体滴度的阳性人群中的细胞免疫水平如何，血浆中是否存在游离EBVDNA? 研究对此进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料 样本:广西壮族自治区苍梧县鼻咽癌普查样本和自治区人民医院鼻咽癌患者。Ficoll-PaquePLUS淋巴细胞分离液(GE,美国)；IgA/VCA抗体检测试剂来自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所；人γ-干扰素Elispot检测试剂盒(BD,美国)；EBVDNA荧光定量试剂(达安基因,中国)。

1.2IgA/VCA抗体 以含EB病毒的B95-8细胞制成抗原片(病毒病预防控制所)，检测普查人群血清中IgA/VCA抗体(≥1:5为阳性)，按2倍稀释梯度确定抗体阳性血清的滴度，具体方法参考文献[5]。

1.3LMP2特异性细胞免疫 静脉抽取抗凝外周血5ml，以淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。按照γ-干扰素Elispot检测试剂盒操作步骤包被抗体，4℃过夜，次日封闭，室温孵育2h。接种细胞1×105/孔，加入LMP2 混合多肽刺激物。同时设立阳性对照1×105/孔(加细胞1×105/孔+ConA刺激1μg/孔)、阴性对照(加细胞1×105/孔)、空白对照(加200μl/孔培养液)。37 ℃ 5%CO2培养24h。去离子水裂解细胞，洗液洗涤后，按说明书步骤依次加入检测抗体、酶标的链霉亲和素和显色液。将ELISPOT板置于BiosysBioreader4000PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。

1.4 血浆中游离EBVDNA采用荧光定量PCR法血浆检测EBV-DNA含量。实时荧光定量PCR仪(ABI公司StepOnePlusTM), 按EB病毒(EBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒说明书进行操作, 提取血浆DNA,取2μl为模板检测血浆中EBVDNA。以去离子水作阴性对照。反应结束，用计算机调取扩增结果。EBVDNA拷贝数≥5×102/ml判定为阳性。

2 结果

2.1 普查人群及IgA/VCA抗体滴度 普查自然人群全部来自广西苍梧县城共1 233人,男性622人占50.4%、女性611人占49.6%。年龄段在30-69岁,各年龄组受检人数及比例为30-35岁、36-40岁、41-45岁、46-50岁、51-55岁、56-69岁各年龄组受检人数分别占9.8%、9.0%、19.0%、18.5%、22.5%、21.2%。通过免疫酶法检测普查人群的血清中IgA/VCA滴度，其中80人IgA/VCA抗体阳性(>1:5)，阳性率为6.0%。其中多数(87.5%)的抗体滴度都在1∶5-1∶20之间，1∶40只占2.5%(见表1)。

表1 苍梧县城30-70岁健康人群VCA/IgA抗体滴度分布

2.2 LMP2 特异性细胞免疫检测80例IgA/VCA抗体阳性人群中，我们获得了有72例的外周血进行了LMP2 特异性细胞免疫检测，其中IgA/VCA抗体滴度1∶5为33人、1∶10 30人、1∶20 7人、1∶40 2人，结果显示随着抗体滴度的升高，LMP2 特异性细胞免疫反应水平降低。从趋势上看抗体滴度为1∶5和1∶10的LMP2 特异性细胞免疫水平较接近，而抗体滴度为1∶20和1∶40 的免疫水平较接近，而在1∶10和1∶20之间降幅较大。本研究同时也对20例未治疗的鼻咽癌患者进行了LMP2 特异性细胞免疫检测，其细胞免疫水平低于IgA/VCA阳性人群,鼻咽癌患者的IgA/VCA抗体滴度均在1∶40以上，对各组数据进行方差分析，IgA/VCA抗体滴度为1∶5人群与鼻咽癌患者组间比较具有统计学意义(见图1)。

表2 血浆中EBV DNA检测

图1 IgA/VCA 抗体阳性人群和鼻咽癌患者LMP2特异性细胞免疫应答Fig.1 LMP2 specific responses in IgA/VCA-positive population and patients with nasopharyngeal carcinoma

2.3 血浆中游离EBV DNA 我们检测了72份IgA/VCA抗体阳性和20份鼻咽癌血浆样本的EB病毒DNA，获得19例阳性样本，IgA/VCA抗体阳性样本8份，鼻咽癌样本11份。EB病毒拷贝数范围从7.6×102/ml至7.5×105/ml不等,鼻咽癌样本血浆中EBV DNA阳性率高于IgA/VCA抗体阳性样本。其中VCA/IgA抗体阳性样本中，血浆EBV病毒载量拷贝数越高，VCA/IgA抗体滴度越高，但方差分析无统计学意义(见表2)。

3 讨论

在20世纪70年代末的大规模的血清学普查表明在人群中，在人群中IgA/VCA抗体阳性率为5.3%(4.7%-6.2%)[6]，2011年的苍梧县城人群普查结果与40年前相似。由于在成人中EBV感染率并没有变化，因而人群中IgA/VCA抗体阳性率亦没有改变，鼻咽癌的发病率亦没有明显的降低。在鼻咽癌细胞中仅表达有限的几种EB病毒抗原：EB病毒核抗原1(EBNA1)和潜伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP)1和2 (LMP1，2)。其中，LMP2是EB病毒编码的晚期表达蛋白质之一, 一种镶嵌在细胞膜上的潜伏膜蛋白,是含有CD8+T细胞识别表位[7],是理想的靶抗原,因此我们用LMP2作为机体针对于EBV的细胞免疫应答。周玲等[3]研究表表明在健康人群、IgA/VCA抗体阳性人群和鼻咽癌患者中，LMP2特异性的细胞免疫水平逐渐降低。本研究的结果表明：随IgA/VCA抗体滴度的升高，LMP2特异性细胞免疫水平降低。IgA/VCA抗体阳性人群的LMP2 特异性细胞免疫水平高于鼻咽癌患者，与周玲等的研究结果一致。血浆中的EBV DNA在临床中作为鼻咽癌治疗后病情进展的一个监测指标，其变化EBV抗体更敏感，而对于EBV IgA/VCA阳性的人群检测尚无不明确。本研究在EBV IgA/VCA阳性样本的血浆中也发现了EBV DNA存在，IgA/VCA抗体滴度分别为1∶10和1∶20，滴度在1∶5和1∶40的样本中未发现，原因可能是抗体滴度在1∶5的人群机体免疫与健康人无异，抑制了EBV病毒复制，血浆中无游离的EBV DNA存在，而抗体滴度1∶40的样本仅有两份，样本数量所致，未显示明显的统计学意义。本研究结果可以提示我们在早期普查中，可以将血清学和EBV DNA载量联合应用。诚然，这仅仅是一次检测的结果，且样本数量较少，对于EBV DNA在早期筛查中的意义，还需要更大的样本，对其动态变化进一步跟踪。

[1] Zeng Y，Li ZL, Wu YC, et al. Prospective studies on nasopharyngeal carcinoma in Epstein-Barr virus IgA/VCA antibody-positive persons in Wuzhou City, China. Int J Cancer, 1985,36:545-547.

[2] Zeng Y, Li ZJ, LY, et al. Follow-up studies on Epstein-Barr virus IgA/VCA antibody-positive persons in Zangwu County, China. Intervirology, 1983,20:190-194.

[3] 周玲，姚庆云，Steven Lee, 等. 鼻咽癌病人和正常人群中EB病毒特异性T细胞对靶抗原的识别和应答. 病毒学报, 2001,17:11-14.

[4] Lin.JC, Wang WL, ChenKY, et al. Quantification of Plasma Epstein-Barr Virus DNA in Patients with Advanced Nasopharyngeal Carcinoma. N Engl J Med, 2004,350:2461-70.:350:2461-70.doi: 10.1056/NEJMoa032260

[5] 曾毅，沈淑静，邓洪,等. 应用抗补体免疫酶法从VCA/IgA抗体阳性者中检查早期鼻咽癌. 中国医学科学院学报, 1982,4:254-525.[6] Zeng Y, Li ZL, HY, et al. Serological mass survey for early 1detection of nasopharyngeal carcinoma in Wuzhou City, China. Int J Cancer, 1982,29:139-141.

[7] Lee SP, Tierney RJ, Thomas WA， et al. Conserved CTL epitopes within EBV latent membrane protein 2: a potential target for CTL-based tumor therapy. J Immunol, 1997, 158:3325-3334.

Detection of EBV-LMP2-specific cell responses and EBV DNA copies in IgA/EBV-VCA positive individuals and patients with nasopharyngeal carcinoma

TanZhenlian,WangYongli,MaiZhiping,LiaoJian,WangZhan,ZhanShaobing,DuHaijun

WuZhouCenterforDiseaseControlandPrevention,WuZhou643200,China(TanZL);ThePeople’sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China(WangYL);CancerControlOfficeofCangWuCounty,WuZhou643200,China(MaiZP,LiaoJ);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China(WangZ,ZhanSB,DuHJ)

DuHaijun,Email:haijun70@126.com

ObjectiveToinvestigatethecorrelationbetweenEBV-LMP2-specificcellresponses,EBVDNAcopiesandtitersofIgAantibodytoviralcapsidantigen(IgA/VCA).MethodsIgA/VCAantibodyweretestedwithimmune-enzymemethod.BothofplasmaandlymphocyteswererespectivelyseparatedfromIgA/VCA-positiveindividualsandpatientswithnasopharyngealcarcinoma(NPC)withouttreatment.EBVDNAcopiesandLMP2-specificcellresponsesweredetectedbyinterferon-gammaElispotsassayandfluorescentquantitativePCRmethod.ResultsIgA/VCAantibodyin80of1 233individualswaspositiveinCangwucounty,andthepositiverateis6%.EBV-LMP2-specificcellresponsesandEBVDNAcopiesweredetectedin72of80IgA/VCApositiveindividualsandpatientswithNPC.EBVDNAcopiesinplasmawereincreasedwithriseoftitersofIgA/VCAantibody,whileEBV-LMP2-specificcellresponsesweredeclined.ConclusionEBV-LMP2-specificcellresponsesandEBVDNAcopiesareprobablyassociatedwithtitersofIgA/VCAantibody.

IgA/EBV-VCA；latentmembraneprotein2;Cellresponses;EBVDNA

杜海军, Email: haijun70@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.019

IgA/ EBV-VCA；潜伏膜蛋白2；细胞免疫；EBV DNA

国家973项目(2011CB504800)；国家863项目(2012AA02A404);环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室课题项目(EV02012021)

2015-12-01)