艾滋病合并慢性乙型肝炎感染患者对拉米夫定耐药的研究

黄思敏 蔡卫平 胡凤玉 廖宝林 兰芸 陈友鹏 唐小平

510630 暨南大学附属第一医院(黄思敏、陈友鹏)；510060 广州市第八人民医院(蔡卫平、胡凤玉、廖宝林、兰芸、唐小平)



·病毒病诊断与治疗·

艾滋病合并慢性乙型肝炎感染患者对拉米夫定耐药的研究

黄思敏 蔡卫平 胡凤玉 廖宝林 兰芸 陈友鹏 唐小平

510630 暨南大学附属第一医院(黄思敏、陈友鹏)；510060 广州市第八人民医院(蔡卫平、胡凤玉、廖宝林、兰芸、唐小平)

目的 了解拉米夫定(3TC)治疗艾滋病(AIDS)/慢性乙型肝炎(CHB)合并感染患者对3TC的耐药情况。方法 收集广州市第八人民医院2005年至2010年接受含3TC方案治疗的AIDS/CHB合并感染患者的资料，检测患者抗病毒治疗前和治疗12个月、24个月、36个月、48个月和60个月时HBV DNA含量，对HBV DNA阳性患者，扩增HBV 逆转录酶区，分析HBV变异情况。 结果 185例患者符合入选标准，治疗前均未发现3TC耐药。治疗过程中，有29例患者检出3TC耐药，其中7例患者在两个不同的随访点检出耐药。29例患者中，有9例治疗前HBV DNA阴性，3例患者是治疗12个月时检出耐药。与非耐药患者相比，耐药患者HBeAg阳性的比例更高(65.5% 比33.3%，P=0.001)，基线HBV DNA水平更高(7.49拷贝/ml 比 6.59拷贝/ml，P=0.017)，使用3TC时间明显延长(40个月比26.5个月，P<0.001)。3TC耐药模式有四种：rtM204I (n=7)、rtL180M (n=2)、rtL180M+rtM204V/I(n=23) 和rtL80V+rtM204I (n=4)。 结论 本地区AIDS/CHB合并感染患者对3TC耐药率低。治疗前HBV DNA阴性患者亦可较早出现耐药。

人类免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)有相似的传播途径，两者合并感染相当常见。我国HIV患者中，HBsAg阳性率为14.6 %[1]。特殊人群中，合并感染率更高[2]。因此，HIV/HBV合并感染患者的治疗和耐药问题不容忽视。

拉米夫定(lamivudine,3TC)是我国艾滋病诊疗常规中推荐的一线抗病毒治疗药物。3TC不但可以抑制HIV逆转录酶，也能抑制HBVDNA聚合酶。3TC治疗HIV的用量为300mg/d，治疗HBV单一感染用量为100mg/d。3TC治疗HBV的耐受性良好，但随用药时间延长，因HBV的变异导致的耐药逐渐增加。本研究以长期接受含3TC(300mg/d)的抗病毒方案治疗艾滋病(AIDS)/慢性乙型肝炎(CHB)合并感染患者为对象，检测患者治疗前和治疗后不同时间HBVDNA的含量，了解3TC的耐药情况，为临床医师合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集广州市第八人民医院2005年至2010年门诊或住院随访的HIV患者的资料。研究对象入选标准为：①经WesternBlot确诊HIV抗体阳性(广州市疾病预防控制中心)；②HBsAg阳性超过6个月；③HAART方案中含有3TC300mg/d，使用6个月以上；④HAART前或随访过程中未使用其他抗HBV的药物；⑤有血清标本保留。排除标准：合并其他肝炎病毒感染。入选患者丙氨酸转移酶(ALT)的检测上限为40U/L。研究通过广州市第八人民医院伦理委员会审查。

1.2 方法

1.2.1 检测HBVDNA:检测患者抗病毒治疗前和治疗满12个月、24个月、36个月和48个月和60个月的HBVDNA水平，检测试剂购自中山大学达安基因股份有限公司，HBVDNA检测下限为500拷贝/ml。

1.2.2 提取HBVDNA:对HBVDNA阳性的标本，使用Qiagen血清DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)按说明书步骤提取HBVDNA。

1.2.3 巢式PCR扩增HBVRT区:设计PCR引物，引物扩增范围为nt45-ntl291。设计的引物送英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。第一轮扩增范围是nt45-nt1291，引物为5’-GCCTRTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAG-3’(nt45-72)和 5’-TCCAGACCKGCTGCGAGCAAAAC-3’(nt1291-1313)。第二轮扩增范围为nt50-nt1264，引物为 5’-TATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3’(nt50-75)和5’-GTTCCGCAGTATGGATCGGCAGAGG-3’(nt1255-1279)。PCR反应条件为：预变性 94 ℃×3min, 变性94 ℃、 30s,退火55 ℃、30s,延伸72 ℃、70s，均为30个循环；后延伸72 ℃、 10min。PCR产物电泳，有目的条带的产物送英潍捷基(上海)公司测序。

1.2.4 确定HBV基因型:使用Chromas和Contig软件对测序结果进行序列拼接。从基因库中选择HBV基因型的标准株(A-H)，构建进化树，根据进化树中的遗传距离分出HBV基因型。

1.2.5 耐药分析:使用BioEdit软件进行序列处理，分析AIDS/CHB合并感染患者抗病毒治疗前和各随访点HBV变异情况。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS16.0软件包处理。计量资料用中位数(四分位间距)[M(IQR)]表示，计数资料以例(%)表示。正态分布计量资料的比较采用t检验，非正态分布计量资料的比较采用非参检验，计数资料的比较采用卡方检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料 符合入选标准的患者有185例，其中男性120例(64.9 %)、女性65例(35.1 %)，年龄中位数为38岁(IQR，33-48岁)。HIV感染的主要途径为异性性传播，有150例(81.1 %)。HBeAg阳性患者71例(38.4%)。ALT中位数为31U/L(IQR，21-50U/L)，AST中位数为38U/L(IQR，27-58U/L)，抗病毒治疗前HBVDNA阳性患者115例(62.2%)，HBVDNA中位数为6.76log10拷贝/ml(IQR，5.05-7.75log10拷贝/ml)。HBV基因B型92例，C型32例。CD4+淋巴细胞计数中位数为45cells/mm3(IQR，12-124cells/mm3)。3TC使用时间中位数为27个月(IQR，17个月-41个月)。

2.2 拉米夫定耐药情况

2.2.1 拉米夫定耐药率:185例患者治疗前均未发现3TC耐药。治疗过程中，出现3TC耐药的有29例。其中7例患者在两个随访点检出耐药，即有36份标本检出耐药。有患者在检出HBVDNA阳性时，并未发现HBV的耐药变异(见图1)。

29例耐药患者中9例患者治疗前HBVDNA阴性，其中3例是治疗12个月时出现耐药、3例是治疗24个月时出现耐药、2例是治疗36个月时出现耐药、1例是治疗48个月时出现耐药。3TC使用时间与HBV DNA阳性率和3TC耐药率的关系见图1。

表1 3TC耐药患者与非耐药患者临床特征的比较

注： ALT为丙氨酸氨基转移酶

Note：ALT is alaninea minotransferase

图1 3TC使用时间与HBV DNA阳性率和3TC耐药率的关系 Fig.1 Relationship between the time of 3TC therapy and the rate of HBV DNA positive and 3TC resistance mutations

2.2.2 拉米夫定耐药相关因素:比较耐药患者和无耐药患者基线HBV DNA等情况，两者在HBeAg阳性比例、基线HBV DNA水平、3TC使用时间和HBV基因型方面存在统计学差异。耐药患者HBeAg阳性的比例更高(65.5% 比33.3%，P=0.001)，基线HBV DNA水平更高(7.49 log10拷贝/ml 比 6.59 log10拷贝/ml，P=0.017)，使用3TC时间明显延长(40个月比26.5个月，P< 0.001)，HBV 基因B型的比例较C型高(93.1 % 比68.4 %，P=0.008)。两组在年龄、性别、基线ALT水平、治疗前HBV DNA阳性比例和基线CD4+水平方面无统计学差异(见表1)。

2.2.3 拉米夫定耐药模式:36份耐药标本，耐药模式有四种：rtM204I (n=7)， rtL180M (n=2)，rtL180M + rtM204V/I (n=23)和rtL80V + rtM204I (n=4)。

3 讨论

3TC是第一个用于抗HBV治疗的口服核苷(酸)类似物(NAs)，不仅有强大的抑制HBV复制的作用，亦能显著延缓肝病进展和减少肝癌的发生[3]。3TC治疗HBV的耐药率随使用时间的延长而增加。Gu等[4]研究了50例使用3TC 300 mg/d治疗的HIV/HBV合并感染患者，96周后，10例(20%)患者可以检测到HBV DNA的复制，其中8例出现3TC的耐药突变。本研究中，3TC 耐药率不高，可能与以下因素有关：首先，可能与HBV基因型有关，本研究中，HBV基因型是B型和C型，Iacomi等[5]认为HBV基因A型和HIV感染是HBV发生rtM204V的独立危险因素。其次，还可能与HBeAg状态有关。本研究中的合并感染患者，一半以上(61.1 %)为HBeAg阴性患者。Wongprasit等[6]研究显示，HBeAg阴性是3TC 耐药的一个保护因素。最后，可能与研究入选标准不同有关，前面提及的研究，入选病例均为治疗前HBV DNA阳性患者，而本研究观察的是接受HAART的患者，不论其抗病毒治疗前HBV DNA水平如何，均为3TC 耐药的观察对象，不少患者在治疗前的HBV DNA是阴性的。

本研究显示，出现3TC耐药的患者中，有9例在抗病毒治疗前HBV DNA是阴性的，在治疗后也出现HBV位点的变异。其中有3例是治疗12个月时检出耐药。这就提示，即使是抗病毒治疗前HBV DNA阴性的病例，在治疗过程中，仍有可能较早出现3TC的耐药。这与Kim等[7]的研究结果不一致，在Kim等的研究中，基线HBV DNA水平低的HIV/HBV合并感染患者，并未观察到3TC的耐药。本研究结果说明对HIV/HBV合并感染患者，不论抗病毒治疗前HBV DNA水平如何，均应加强耐药监测，以防耐药株的传播。

本研究中，也有部分患者检出病毒复制，但无发现HBV耐药变异位点。这可能与患者治疗依从性有关，也可能是其他的原因。Hongthanakorn等[8]研究了148例接受NAs治疗的CHB患者，有10例患者出现病毒学突破时，未检出耐药突变，继续治疗，也未检出耐药突变。因此作者认为，在NAs治疗过程中，病毒学突破是常见的临床表现，但并不是所有的病毒学突破都由病毒耐药突变引起。

综上所述，本地区AIDS/CHB合并感染患者对3TC耐药率低。治疗前HBV DNA阴性患者亦可较早出现耐药。本研究尚存在不足，如对患者HBV DNA的检测频率不够，因此不能更精确发现患者最早出现耐药的时间和耐药的变化规律；治疗满48个月和60个月的病例数较少。

[1] Wang HL, Li YJ, Zhang CD, et al. Immunological and virological responses to cART in HIV/HBV co-infected patients from a multicenter cohort [J]. AIDS, 2012, 26(14): 1755-1763. doi: 10.1097/QAD.0b013e328355ced2.

[2] 熊素平, 陈凯, 刘娜, 等. 天津某区特殊人群HIV感染者合并HBV、HCV、HGV、TB感染的调查分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2015,29(1): 47-49. doi:10.3760/ema.j.issn.1003-9279.2015.01.016.

[3] Liaw YF, Sung JJ, Chow WC, et al. Lamivudine for patients with chronic hepatitis B and advanced liver disease [J]. N Engl J Med, 2004, 351(15):1521-1531.doi: 10.1056/NEJMoa033364.

[4] Gu L, Han Y, Li Y, et al. Emergence of lamivudine-resistant HBV during antiretroviral therapy including lamivudine for patients coinfected with HIV and HBV in China [J]. PLoS One, 2015, 10(8):e0134539. doi: 10.1371/journal.pone.0134539.

[5] Iacomi F, Vincenti D, Vairo F, et al. Effect of HIV co-infection on mutation patterns of HBV in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B [J]. J Med Virol, 2009, 81(7):1151-1156. doi: 10.1002/jmv.21505.

[6] Wongprasit P, Manosuthi W, Kiertiburanakul S, et al. Hepatitis B Virus Drug Resistance in HIV-1-Infected Patients Taking Lamivudine-Containing Antiretroviral Therapy [J]. AIDS Patient Care and STDs, 2010,24(4):205-209. doi: 10.1089/apc.2009.0322.

[7] Kim HN, Scott J, Cent A, et al. HBV lamivudine resistance among hepatitis B and HIV coinfected patients starting lamivudine, stavudine and nevirapine in Kenya [J]. J Viral Hepat, 2011, 18(10): e 447-e 452. doi: 10.1111/j.1365-2893.2011.01466.x.

[8] Hongthanakorn C, Chotiyaputta W, Oberhelman K, et al. Virological breakthrough and resistance in patients with chronic hepatitis B receiving nucleos(t)ide analogues in clinical practice [J]. Hepatology, 2011, 53(6):1854- 1863. : 10.1002/hep.24318.

Analysis on lamivudine resistance mutations of patients with AIDS/CHB co-infection

HuangSimin,CaiWeiping,HuFengyu,LiaoBaolin,LanYun,ChenYoupeng,TangXiaoping.

TheFirstHospitalAffiliatedJinanUniversity,Guangzhou510630,China(HuangSM,ChenYP);Guangzhou8thPeople’sHospital,Guangzhou510060,China(CaiWP,HuFY,LiaoBL,LanY,TangXP)

TangXiaoping,Email:xiaopingtanggz@yahoo.com

ObjectiveToinvestigatetheprevalenceandpatternsoflamivudine(3TC)resistancemutationsinacquiredimmunedeficiencysyndrome(AIDS)/chronichepatitisB(CHB)co-infectedpatientsreceiving3TCasapartofantiretroviraltherapy.MethodsDataofpatientswithAIDS/CHBco-infectionfrom2005to2010werecollected.HBVDNAwastestedatthetimeofhighlyactiveantiretroviraltherapy(HAART)andafter12, 24, 36, 48and60monthstherapy.HBVreversetranscriptase(RT)wasamplifiedindetectablesamples. 3TCresistancemutationswereidentified.Results185co-infectedpatientswereenrolled. 3TCresistancemutationswerenegativeatthetimeofHAART. 3TCresistancemutationsoccurredin29co-infectedpatientsaftertreatment,ofthese, 7patientsweredetectedresistancemutationsintwodifferentpoints. 9patientswereHBVnon-viraemiaatthetimeofantiviraltherapy.Resistancemutationsweredetectedafter12monthstherapyin3patients.Patientswith3TCresistancemutationsweremorefrequentlyHBeAgpositive(65.5%vs. 33.3%, P=0.001),hadhigherHBVviralload(7.49copies/mlvs. 6.59copies/ml, P=0.017)andlongerdurationof3TC(40monthsvs. 26.5months, P<0.001)thanpatientswithout3TCresistancemutations.Fourpatternsof3TCresistancemutationsweredetected:rtM204I(n=7),rtL180M(n=2),rtL180M+rtM204V/I(n=23)andrtL80V+rtM204I(n=4).ConclusionsTheprevalenceof3TCresistancemutationsislowamongAIDS/CHBco-infectedpatientsinGuangzhou.PatientswithHBVDNAnegativebeforeHAARTarelikelytodevelopresistanceearlyduringtherapy.

AIDS;HepatitisB,Chronic;Co-infection;Lamivudine;Resistancemutations

唐小平，Email: xiaopingtanggz@yahoo.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.014

艾滋病；肝炎，乙型，慢性；合并感染；拉米夫定；耐药

2015-04-06)