LPS和R848对Tfh细胞表达Ki67和BcL6以及CXCR5的影响

黄磊 傅庭焕 李林 许文 谭向龙 聂为民 周先志 貌盼勇

100853 北京，解放军医学院(黄磊、谭向龙、貌盼勇)；100039 北京，解放军第三○二医院(黄磊、聂为民、周先志、貌盼勇)；100048 北京，解放军总医院第一附属医院(傅庭焕)；100071 北京，军事医学科学院(李林)



·论著·

LPS和R848对Tfh细胞表达Ki67和BcL6以及CXCR5的影响

黄磊 傅庭焕 李林 许文 谭向龙 聂为民 周先志 貌盼勇

100853 北京，解放军医学院(黄磊、谭向龙、貌盼勇)；100039 北京，解放军第三○二医院(黄磊、聂为民、周先志、貌盼勇)；100048 北京，解放军总医院第一附属医院(傅庭焕)；100071 北京，军事医学科学院(李林)

目的 评估HIV感染及感染后微生物易位对滤泡辅助T淋巴细胞(T follicular helper cells，Tfh)功能的影响。方法 选取非HIV感染者外周浅表淋巴结(Lymph nodes,LNs)，分离淋巴细胞，在存在或不存在HIV感染情况下，分别以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和R848刺激；采用流式细胞术检测Tfh细胞表达Ki67、BcL6和CXCR5情况。结果 LPS和R848刺激可促使Tfh细胞扩张并高表达BcL6，与LPS比，R848起效晚，但效果更强。虽然LPS可协助HIV抑制Tfh细胞表达BcL6，但HIV-1可能才是Tfh细胞下调BcL6表达的根本原因。此外，LPS和R848刺激可导致Tfh细胞下调CXCR5表达，使Tfh细胞接受CXCL13趋化定位的能力降低。结论 HIV感染是导致Tfh细胞功能异常的根本原因，但消化道微生物产物的漏入可能在感染后Tfh细胞功能异常中，起到了协同增效作用。因此，抑制感染后微生物产物易位，可能改善感染者体液免疫功能。

滤泡辅助T淋巴细胞(T follicular helper cells, Tfh)是一个特殊的CD4+T淋巴细胞亚群，定居在淋巴结(lymph nodes, LNs)的B细胞淋巴滤泡中，对生发中心(germinal center, GC)抗原特异性B细胞的生存、增生、分化以及抗体类型转换起着关键性的辅助作用[1]。因此，Tfh细胞的正常功能对于疫苗的设计非常重要。同时，Tfh细胞也在自身免疫性疾病中，扮演着重要角色[2]。近年研究发现， Tfh细胞对HIV非常易感，但其数量并没有因为感染而减少，反而增加了[3]。HIV感染后Tfh的异常可能导致了体液免疫受损。研究发现其数量与GC中B细胞的数量正相关，但与记忆性B细胞负相关[3]。HIV感染导致消化道免疫和物理屏障受损，消化道微生物产物大量入血[4]。但是，目前对微生物产物易位是否会导致Tfh细胞的扩张和功能改变仍不清楚。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，而R848是一种模拟源性病毒的单链 RNA 分子。为了阐述慢性HIV感染中，病原微生物产物对Tfh的影响，我们从非HIV感染者外周浅表LNs中分离淋巴细胞，以LPS、R848刺激或HIV-1感染加LPS、R848刺激作用于淋巴细胞，并检测Tfh细胞表达Ki67、CXCR5及BCL6的改变，以期为理解HIV感染中Tfh细胞功能及体液免疫的改变有所帮助。

1 材料与方法

1.1 患者和组织标本 解放军第302医院及解放军总医院第一附属医院2013至2015年就诊患者中，留取因外周浅表LNs肿大行活检的非HIV感染者的LNs。将LNs分为两部分，一部分4%多聚甲醛固定、石蜡包埋，另一部分用于分离淋巴细胞。石蜡包埋的LNs经常规切片，HE染色后，选取其中经临床和病理证实排除肿瘤和感染的病例20例(颈部2例、腋窝3例，腹股沟15例)，将分离的淋巴细胞进行下一步实验。患者中位年龄为34岁(16岁-49岁)，其中男性12例、女性8例。常规手术留取LNs前均签订知情同意书，并经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 LNs中淋巴细胞的分离 常规手术方法取LNs后，将其四分之三部分放于孔径150 μm 的细胞筛网上，用常规方法研磨、分离淋巴细胞[5]。

1.3 HIV-1(X4嗜性)质粒的转染 HIV-1(X4嗜性)质粒为中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心惠赠。将293T细胞(约5×107个)按1∶4体积比加入RPMI-1640培养基，接种于培养皿(直径10 cm)中，总体积20 ml。次日，按上述体系再传代1次。随后将HIV-1(X4嗜性)质粒(相当24 μg的DNA)加入1.5 ml Opti-MEMⅠ培养基中，混匀后，将60 5 μl的 lipofectamine TM 2000加入其中，孵育5 min。混合稀释的质粒DNA和lipofectamine TM 2000，轻摇并室温孵育20 min。随后将混合物加入到293T细胞的培养皿中混匀，37 ℃的CO2孵育箱孵育48 h，收取上清。

1.4 淋巴细胞的刺激 将新鲜分离的淋巴细胞计数后，立即接种在6孔板中，每孔2×105个细胞。分别加入LPS(20 ng/ml)和R848(1 μg/ml)。每种刺激剂各两孔，分别培养5 d和8 d后，加入胰蛋白酶消化后，重新用PBS悬浮，留待下一步流式细胞染色用。以上实验共使用LNs10枚。

HIV-1(X4嗜性)感染淋巴细胞基本实验步骤同上。鉴于HIV-1感染所导致的细胞损失，每孔加入3.5×105个细胞。分为HIV组、HIV+LPS组和HIV+R848组。每组各两孔，分别培养5 d和8 d。HIV-1(X4嗜性)DNA浓度为150 ng/ml。以上实验共使用LNs10枚。每组均以不加任何刺激剂、培养相应时间的淋巴细胞作为对照。

1.5 流式细胞检测 将刺激或感染后的淋巴细胞重新悬浮于PBS中，进行细胞计数，保证细胞浓度>2.5×105/ml，取200 μl细胞悬液置于流式管中，根据不同染色方案，常规进行细胞表面抗CD3、抗CD8、抗CD45RO、抗CXCR5、抗PD1染色后，加入200 μl PBS重悬，以穿膜试剂盒(eBioscience公司)按操作说明进行穿膜，加入抗Ki67、抗BcL6流式抗体染色后，立即上流式细胞仪(美国BD公司 FACScanto型)。因HIV-1感染会导致CD4下调， 以CD3+CD8-代表CD4+T淋巴细胞，故Tfh细胞圈门策略为CD3+CD8-CD45RO+, CXCR5+PD1+(图1)。

a 圈出淋巴细胞，b 以CD3阳性，CD8阴性定义CD4+T淋巴细胞，c 从CD4+T淋巴细胞进一步选出CD45RO+CD4+T淋巴细胞，d 选出前者中CXCR5+PD1+细胞，即为Tfh细胞。图1 Tfh细胞圈门策略a Gatng lymphocytes, b Defining CD4+T Cells as CD3+CD8- cells from lymphocytes, c Choosing CD45RO+ cells from the former, d Gating CXCR5+PD1+ from the former as Tfh cellsFig.1 Gate strategy of Tfh

a 刺激5 d后Tfh表达Ki67的变化，b 刺激8 d后Tfh表达Ki67的变化图2 LPS和R848对Tfh细胞增生的影响a The alteration of Ki67 expression in Tfh after 5 days of stimulation. b The alteration of Ki67 expression in Tfh after 8 days of stimulationFig.2 Contribution of LPS and R848 to proliferation of Tfh

2 结果

2.1 LPS和R848的刺激对Tfh细胞增生的影响 Ki67是一个细胞增殖的标记物。为了LPS和R848对Tfh细胞增生的影响，我们检测了被LPS和R848刺激5 d、8 d后，LNs分离淋巴细胞中Tfh细胞表达Ki67的情况。结果显示，第5天时，LPS刺激组Tfh表达Ki67水平(21.9±3.97)明显升高，与对照组(7.16±1.89)和R848组(9.16±3.19)组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，而R848刺激组表达水平虽较对照组高，但差异无统计学意义(P=0.497)；在第8天时，LPS组(21.15±5.18)和R848组(36.6±3.62)Tfh表达Ki67水平均显著升高，与对照组(12.56±2.83)相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，R848组表达水平也较LPS组高，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.2 LPS和R848的刺激对Tfh细胞表达BcL6的影响 第5天时，LPS组(67.98±10.7)和R848组(60.53±6.7)Tfh细胞BcL6表达水平显著升高，与对照组(43.28±6.82)比差异均有统计学意义(P<0.05)，与R848组比，LPS组表达更高，但差异无统计学意义(P=0.17)；第8天， R848组(89.43±6.83)BcL6表达升高最显著，与对照组(52.33±7.94)和LPS组(60.63±7.93)比差异均有统计学意义(P<0.05)，虽然LPS组比对照组表达水平高，但差异无统计学意义(P=0.063)(图3)。

a 单纯刺激5天后Tfh表达BcL6的变化，b 单纯刺激8 d后Tfh表达BcL6的变化，c 感染并刺激5 d后Tfh表达BcL6的变化，d 感染并刺激8 d后Tfh表达BcL6的变化图3 HIV-1、LPS和R848对Tfh细胞BcL6表达的影响a The alteration of BcL6 expression in Tfh after 5 days of stimulation. b The alteration of Bcl6 expression in Tfh after 8 days of stimulation. c The alteration of BcL6 expression in Tfh after 5 days of stimulation along with infection. d The alteration of Bcl6 expression in Tfh after 8 days of stimulation along with infectionFig.3 Contribution of HIV-1, LPS and R848 to BcL6 expression of Tfh

2.3 HIV-1感染及LPS和R848的协同作用对Tfh细胞表达BcL6的影响 用HIV-1X4嗜性病毒株感染LNs分离的淋巴细胞，同时给予LPS或R848刺激，结果表明：无论是在第5天(30.66±6.11)或是第8天(32.85±4.73)，HIV-1单纯感染组Tfh细胞的BcL6表达，与对照组(分别为48.67±6.29，53.99±6.31)相比差异均有统计学意义(P<0.05)；与单纯LPS刺激相反，HIV-1+LPS组均显著降低了Tfh细胞BcL6的表达，但仅在第5天时(15.02±5.07)与HIV-1单纯感染组相比差异有统计学意义(P<0.05)，8 d时(25.2±7.21)差异并无统计学意义(P=0.128)，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；刺激5 d和8 d后，HIV-1+R848组的Tfh细胞BCL6的表达与对照组比均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，但与单纯HIV-1感染组相比差异无统计学意义(P=1.0)，与HIV-1+LPS组相比仅刺激5 d时差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

a 刺激5 d后Tfh表达CXCR5的变化，b 刺激8 d后Tfh表达CXCR5的变化图4 LPS和R848对Tfh细胞CXCR5表达的影响a The alteration of CXCR5 expression on Tfh after 5 days of stimulation. b The alteration of CXCR5 expression on Tfh after 8 days of stimulationFig.4 Contribution of LPS and R848 to CXCR5 expression of Tfh

2.4 LPS和R848的刺激对Tfh细胞表达CXCR5的影响 刺激后第5天，LPS组(153.3±34.43)和R848组(133.51±19.97)的Tfh细胞CXCR5表达水平下降，与对照组(751.49±62.66)相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，LPS组与R848组相比差异无统计学意义(P=0.933)；刺激后第8天与刺激5 d相似，LPS组(166.42±52.88)和R848组(184.02±43.77)CXCR5表达下降，与对照组(829.28±48.95)相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，而LPS组与R848组相比差异无统计学意义(P=1.0)(图4)。

3 讨论

抗体可通过多种机制阻止病毒进入宿主细胞，清除感染细胞，在抗病毒感染中发挥着重要作用。然而，HIV却进化出一套精密的机制逃避中和抗体反应，继而导致感染慢性化[6]。同时，HIV还可影响抗体反应的质量，表现为慢性HIV感染中的高γ球蛋白血症，对蛋白疫苗反应能力下降，和抗原特异性记忆B细胞减少[7]。近期的一些研究发现慢性HIV感染中， Tfh细胞在HIV感染者淋巴滤泡中的聚集，以及功能改变可能是HIV逃脱体液免疫的基础[3]。

B细胞接受同源Tfh细胞的辅助后，经两条不同的途径分化为分泌抗体细胞。滤泡外途径主要产生短寿命、低亲和力浆细胞。而滤泡内途径主要发生在GC，在此进行抗体亲和力突变反应，获得选择性竞争优势的B细胞在Tfh细胞的辅助下，最终分化为长寿命记忆性B细胞或记忆性浆细胞[8]。根据BCL6表达水平，Tfh细胞可以分为两个亚群，低表达BCL6的Tfh细胞，通常被称为前体Tfh细胞，和高表达BCL6的GC Tfh细胞。前体Tfh细胞主要定居于滤泡或毗邻滤泡的区域，仅为B细胞能提滤泡外辅助，而GC Tfh细胞定居于GC内，对于GC的发育和B细胞的选择至关重要[9，10]。与前体Tfh细胞相比，GC Tfh细胞表达更高的CXCR5、PD1、ICOS和CXCL13，分泌更多的IL-21。BcL6是Tfh细胞分化的主要调控者，可通过拮抗Blimp-1促使CD4+T淋巴细胞向Tfh细胞方向分化[11]。CXCR5是CXCL13的配体，可以表达于Tfh细胞和B细胞表面。

我们的实验结果显示，虽然LPS和R848刺激可以促进Tfh细胞的扩张，上调Tfh细胞BcL6的表达，但是在非HIV-1感染条件下这些刺激却导致了CXCR5下降，这意味着Tfh细胞接受CXCL13趋化定位于淋巴滤泡中的能力降低。同时,HIV-1感染可以抑制Tfh细胞表达BcL6，而LPS在HIV-1感染条件下可以增强这种效应，因此可协同HIV-1下调BcL6表达。此外，根据刺激5 d和刺激8 d时Ki67和BcL6表达情况，表明R848对Tfh细胞的刺激作用较LPS起效晚，但作用效果更强。上述结果提示，在HIV-1感染条件下，微生物产物所导致的Tfh细胞的扩张，但并没有催生大量GC Tfh细胞的产生，而是诱导非GC Tfh细胞扩张。这种扩张的最终结果导致了体液免疫的质量下降。

总之，我们的研究结果提示，HIV感染后消化道微生物产物的漏入可能刺激了Tfh细胞的扩张，但同时导致了其功能的受损，HIV本身可能是导致Tfh细胞功能异常的根本原因。因此，抑制感染后大量微生物产物的易位，可能改善感染者体液免疫功能。

[1] Crotty S. T follicular helper cell differentiation, function, and roles in disease[J]. Immunity, 2014, 41(4):529-542. doi: 10.1016/j.immuni.2014.10.004.

[2] Simpson N, Gatenby PA, Wilson A, et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheum, 2010,62(1):234-244. doi: 10.1002/art.25032.

[3] Lindqvist M, van Lunzen J, Soghoian DZ, et al. Expansion of HIV-specific T follicular helper cells in chronic HIV infection[J]. J Clin Invest,2012,122(9):3271-3280. doi: 10.1172/JCI64314.

[4] Lackner AA, Mohan M, Veazey RS. The gastrointestinal tract and AIDS pathogenesis. Gastroenterology,2009,136(6):1965-1978.

[5] 黄磊，邓建宁，许文，等.HIV感染后不同病程阶段淋巴结中CD4+下淋巴细胞各亚群频率的改变[J].传染病信息，2012，25(3)：347-350.

[6] Kwong PD, Doyle ML, Casper DJ, et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites[J]. Nature,2002,420(6916):678-682.

[7] Moir S, Fauci AS. B cells in HIV infection and disease[J]. Nat Rev Immunol,2009, 9(4):235-245. doi: 10.1038/nri2524.

[8] Vinuesa CG, Tangye SG, Moser B, et al. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity[J]. Nat Rev Immunol, 2005, 5(11):853-865.

[9] Baumjohann D, Preite S, Reboldi A, et al. Persistent antigen and germinal center B cells sustain T follicular helper cell responses and phenotype.Immunity[J]. 2013,38(3):596-605. doi: 10.1016/j.immuni.2012.11.020.

[10] Karnowski A, Chevrier S, Belz GT, et al. B and T cells collaborate in antiviral responses via IL-6, IL-21, and transcriptional activator and coactivator, Oct2 and OBF-1[J]. J Exp Med, 2012, 209(11):2049-2064. doi: 10.1084/jem.20111504.

[11] Crotty S, Johnston RJ, Schoenberger SP. Effectors and memories: Bcl-6 and Blimp-1 in T and B lymphocyte differentiation[J]. Nat Immunol,2010, 11(2):114-120. doi: 10.1038/ni.1837.

Impact of LPS and R848 stimulating to Ki67, BcL6 and CXCR5 expression of T follicular helper cells

HuangLei,FuTinghuan,LiLin,XuWen，TanXianglong,NieWeimin,ZhouXianzhi,MaoPanyong

MedicalschoolofChinesePLA,Beijing100853,China(HuangL,TanXL,MaoPY);PLA302Hospital,Beijing100039,China(HuangL,NieWM,ZhouXZ,MaoPY);FirstAffiliatedHospitalofPLAGeneralHospital,Beijing100048,China(FuTH)；AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100071，China(LiL)

ZhouXianzhi,Email:zxz.302@163.com；MaoPanyong,Email:maopy302@163.com

Objective To evaluate the possible impact of HIV infection and microbic products on the function of T follicular helper cells(Tfh). Methods Lymph nodes of non-HIV infected individuals were recruited, and then ground gently and isolated into single lymphocytes. Ki67, BcL6 and CXCR5 expressions of Tfh were determined by flow cytometry after stimulation of lipopolysaccharide(LPS) and R848, or along with HIV-1 infection, respectively. Results The stimulation of LPS and R848 induced the expansion and BcL6 expression of Tfh. These effects of R848 started late but were stronger comparing to LPS. HIV-1 was intrinsic reason which downregulated the expression of BcL6 in Tfh, but LPS played a synergetic role in that. Moreover, the stimulation of LPS and R848 also downregulated the expression of CXCR5 in Tfh surface, which could impeded the ability of Tfh locating in lymphoid follicle. Conclusions HIV is the intrinsic reason which results in the abnormal function of Tfh, but the translocation of microbic products play a synergetic role. Therefore, inhibiting the translocation of microbic products could improve the adaptive immunity of host.

Aequired immunodeficiency syndromes; Acquired immunodeficiency syndrome; T follicular helper cells; lymph nodes; lipopolysaccharide

周先志，Email：zxz.302@163.com；貌盼勇，Email: maopy302@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.005

获得免疫缺陷综合征；艾滋病；滤泡辅助T淋巴细胞；淋巴结；脂多糖

2016-03-21)