下一代测序（NGS）技术的发展及在肿瘤研究的应用

邵向阳 徐伟文

·述评·

下一代测序（NGS）技术的发展及在肿瘤研究的应用

邵向阳 徐伟文★

下一代测序（next-generation sequencing，NGS）由于高灵敏度、高通量、高度自动化等特性，近年来在疾病的研究和诊断治疗中越来越多地被应用。下一代测序技术的发展为肿瘤分子生物学的研究提供了新的手段。本文就下一代测序技术的种类、特点、发展趋势及其在肿瘤研究中的应用作简要的综述。

下一代测序（NGS）；肿瘤；精准医疗

随着分子生物学技术的不断发展，人类对生命现象和疾病的研究已经不再局限在单个基因位点，而是将目光集中于全基因组方面。Sanger测序法是科学研究和临床实验室里首选的测序金标准技术［1］，人类基因组计划就是依靠Sanger测序法才得以完成的［2］。随着技术革新，DNA测序技术得到了不断的创新，在保证测序准确度的前提下，逐步优化操作程序，使得测序速度逐渐提高，测序成本也呈下降趋势，下一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）就应运而生，并在随后得到突破性进展。《Nature Methods》在2007年评选的生物领域影响力最大的技术中，NGS技术以高票当选［3］。与Sanger测序技术不同，NGS技术通过反复测序同一区域的DNA片段，达到更高的灵敏度和准确度，同时通量高、自动化程度高，可在短时间内完成对上百亿碱基的测序［4］，使得在几天内完成人类全基因组测序成为可能［5-7］。也正因为NGS技术的高准确度、高速度以及低成本，对推动分子生物学的发展起到了重要作用，为肿瘤分子生物学的研究提供了新的手段，尤其在肿瘤分子诊断领域更是占有更重要的地位。

1 二代测序技术简介及特点

2005年世界上首台新一代测序仪问世，并且很快就被应用到了如火如荼的分子生物学领域当中。NGS技术，并不是某种单一的技术，而是一个技术群。不同的NGS平台，在其原理上有所不同。基本的原理都是在DNA进行PCR扩增时，借助一些化学标志物在碱基插入DNA链时发出的信号来读取序列信息，信号可以是光信号，也可以是H+流信号（H ion fluxes）。

1.1 Roche/454［5］

454公司开创了边合成边测序的先河，后期又推出了GSFLX系统，主要采用焦磷酸测序（pyrosequencing）原理（图1［8］）。

GS FLX系统的流程概括起来，就是“一个片段=一个磁珠=一条读长（one fragment=one bead= one read）”。“一个片段=一个磁珠”是指长度为300～800 bp的DNA片段与接头（3’和5’端具有特异性）连接，带有接头的单链DNA片段构成样本文库，特别设计的DNA捕获磁珠固定单链DNA文库，每一个磁珠只能与一种独特的单链DNA片段结合。随后把结合DNA片段的磁珠和PCR扩增试剂的水溶液注入到矿物油中，形成油包水混合物，这样就形成只包含一个结合DNA片段的磁珠和PCR扩增试剂的微反应器。乳液PCR在各自的微反应器里独立扩增，排除其他污染性和竞争性的影响。每一个片段经扩增后产生几百万个相同的拷贝，乳液混合物被打破后，扩增片段仍结合在磁珠上。“一个磁珠=一条读长”是指将捕获DNA的磁珠放入PTP板中进行测序反应，PTP板只能容纳一个磁珠。将PTP板放在GS FLX中4种碱基依次按照T、A、C、G的顺序循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对就会释放一个焦磷酸，这个焦磷酸在ATP硫酸化酶（adenosine triphosphate-sulfurylase）和荧光素酶的作用下，经反应，最终把荧光素氧化形成氧化荧光素，同时产生光信号，被电荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）光学系统捕捉一个特异的检测峰值，依据峰值即可读出准确的DNA序列信息［9］。每个磁珠都产生一条读长，通过GSFLX系统分析，最后得出样本的DNA序列信息。

焦磷酸测序法的准确率在99％以上。主要错误类型是插入-缺失，而不是替换，是因为相同碱基的连续插入，没有终止原件阻止单个循环的连续插入，相同碱基的长度需从信号强度中推断出来，在这过程就可能产生误差。

1.2 Illumina/Solexa［10］

Illumina公司的二代测序仪Genome Analyzer最早是由Solexa公司研发的，其核心专利技术是“DNA簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator）”。其原理（图2［8］）是：将基因组DNA经超声波打断成几百bp甚至更小的片段；然后进行末端修复补平加碱基A；再加上接头（adapter）制备成文库。将样本文库加入到专利的芯片（flowcell）上，芯片表面种植了通过共价键链接2种与接头互补的寡核苷酸引物。文库经变性变成单链，其一端与芯片一种引物结合固定，另一端随机与附近的另一个寡核苷酸引物互补固定，形成单链桥状结构；并且以周围的寡核苷酸引物为扩增引物，在芯片上进行扩增，形成2条链。双链再次变性成单链，继续上述PCR过程扩增，这就是所谓的桥式PCR扩增。连续重复上述过程，待测DNA数量就会以指数方式增长，形成DNA簇。“可逆性末端终结”是指在测序过程中，使用“可逆终止子”进行边合成边测序。“可逆终止子”是带有荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），但在3′-羟基端带有可被化学切割的基团，这些基团能够封闭dNTP的3′端黏性，阻止另一个dNTP与之相结合。使得每一步反应只能延伸一个碱基，采集完荧光信号，荧光基团去除，封闭基团被去掉，进行下一步反应，每步收集的荧光信号，对应所检测的序列。如此反复，得出片段的精确序列。

Genome Analyzer测序原理采用稳定的可逆终止法边合成边测序技术，该技术使用4种含有末端阻断基团和不同荧光信号的碱基进行模板互补链的合成，不仅确保了测序的高精确性和高顺序性，而且排除了由重复序列和同聚物导致的测序错误。

1.3 Life/SOLiD［11］

SOLiD应用连接法测序，同时利用了独特的双碱基编码原理。以连接反应代替了传统的聚合酶连接反应。SOLiD测序在文库构建和PCR扩增方面，与GS FLX系统很类似，都是通过磁珠接头捕获待测DNA片段，然后进行乳液PCR。SOLiD的磁珠只有1μm，比GS FLX系统的磁珠小的多。SOLiD连接反应的底物是长度8 bp的特殊单链荧光探针，其3’端第1、2位构成的碱基对是表征探针染料类型的编码区，5’末端被标记4种荧光染料，因此不同的序列组合就被标记上不同的荧光基团。单向SOLiD测序包括5轮测序反应，每轮反应由多个连接反应构成，探针与测序引物相邻近的序列杂交，用颜色判断碱基序列，读取信号。然后通过化学方法在第5和第6位之间切割，把荧光信号淬灭，以进行下个位置的测序。第一次连接反应实际上连接上了5个碱基，通过这种方法，每次测序的位置都相差5位，即第一次测1和2位，第2次测6和7位……在测到末尾后，依次类推，进行第2轮连接反应；由于第2轮测序比第一轮测序往前移动了一个碱基，得到0～1位、5～6位……的荧光信息，5轮反应后，测出全部位置并且每个位置都被检测了2次。

SOLiD测序技术在测序过程利用了独特的双碱基编码原理，能对测序错误进行校正，减少原始数据错误。以连接反应代替了传统的聚合酶连接反应能明显减少因碱基错配而出现的错误，在测序过程中更换引物也能减少背景噪音和错误率。目前SOLiD系统声称其原始碱基数据的准确度大于99.94％，而且SOLiD 4系统将再度升级。SOLiD 4 HQ package将使每次运行产生300GB可定位的序列数据，并带来99.99％的准确率［12］。

1.4 Ion Torrent测序平台

Ion Torrent的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。Ion torrent的基本原理是：把DNA链固定在半导体芯片的微孔中，随后依次掺入ACGT碱基。随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。具体过程是：将待测DNA片段2端加上Ion Torrent测序接头制备成DNA文库。将文库克隆到离子微球颗粒上并进行乳液PCR扩增。将含有扩增模板的离子微球颗粒加入到半导体芯片上，测序时一个个碱基连续流过芯片微孔。如果碱基与特定微孔中的DNA分子互补，则该碱基被合成到DNA分子中，DNA链每延伸一个碱基时，就会释放一个质子（H+），导致局部pH发生变化。离子传感器检测到pH变化后，即刻便从化学信息转变为数字电子信息。如果DNA链含有2个相同的碱基，则记录电压信号是双倍的。如果碱基不匹配，则无H+释放，也就没有电压信号的变化。

Ion Torrent测序技术直接检测DNA的合成，因少了CCD扫描、荧光激发等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。通过对H+的检测，明显改善碱基判读准确性，测序成本低；该系统无需光学检测和扫描系统，无需标记荧光染料和化学发光的配套试剂，技术的读长相对较短。但若单个碱基连续重复出现多次，会导致一个循环里产生大量的H+，引起pH值的剧烈变化，导致信号不准确。

1.5 华大基因CG测序平台［13-14］

CG平台拥有2种独特的测序相关技术：DNA纳米球芯片和组合探针锚定连接测序技术。DNA纳米球芯片制备（图3A）：由DNA片段和2个接头组成DNA文库。测序时接头作为读取起始位点，可从DNA与接头连接处每次最多读取10个连续碱基，然后单链环状DNA分子通过滚环复制，形成一个包含200多个拷贝的DNA纳米球。将建库得到的DNA纳米球采用高密度DNA纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内，每个小孔只能容纳一个DNA纳米球，DNA纳米芯片的占用量超过90％，每一个制备好的芯片可容纳1 800亿个碱基用于成像。组合探针锚定连接法（图3B）：组合探针锚定连接法利用4种不同颜色标记的探针去读取接头附近的碱基，每次最多读取10个连续碱基且每次测序是相互独立的，在测序时，加入anchor与接头互补配对，然后DNA连接酶将4种不同颜色标记的探针结合到模板的相应碱基上，通过对荧光基团的成像来判断碱基类型。

表1 各测序平台原理和优缺点Table 1 The principles，advantages and disadvantages of the sequencing platform

CG平台采用高密度DNA纳米芯片技术，在芯片上嵌入DNA纳米球，然后用复合探针-锚定分子连接技术来读取碱基序列。由CG开创的从头拼接（local de novo）技术，可精确检测等位基因杂合子突变，灵敏性高；采用组合探针锚定连接法技术来读取碱基可明显减少探针和酶的浓度。与边合成边测序不同，组合探针锚定连接法每个cycle可一次性读取数个碱基，这样消耗的测序试剂和成像时间都大大减少。每次测序都是相互独立的，测序结果不受前一个碱基测序结果的影响，因此不会发生错误累积的现象。

以上5大技术产品平台是目前NGS的主流。它们技术原理不尽相同，各有自己的优缺点（表1），在科研和临床应用中发挥着重要的作用。

2 下一代测序技术在肿瘤研究中的应用

随着人类基因组计划的完成和测序技术的不断发展，NGS技术不仅保持高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度，在医学领域得到广泛应用。尤其在肿瘤分子诊断领域（cancer molecular diagnostics）更是当仁不让的主力军。

2.1 NGS在血液肿瘤中的应用

自Ley等［15］在2008年首次报道了利用NGS技术对1例正常核型的急性髓细胞性白血病的基因组分析后，NGS就被广泛应用于肿瘤领域。在2012年美国血液学会（American Society of Hematology，ASH）年会上关于测序（sequencing）的文献共有643篇；其中，应用NGS的文章有220篇，涉及到急性白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、再生障碍性贫血、止血与血栓疾病等各类血液学疾患。对于一些临床表现非常相似的血液病如免疫缺陷病（severe combined immunodeficient disease，SCID）、血小板功能失调症，诊断变得很困难，传统的细胞学检测可能出现漏诊。鉴于NGS技术的高通量、高灵敏等优势，近几年来被越来越多地用于血液病的临床诊断治疗中。Sanger测序的敏感度只有15％～20％，低于此频率的突变检测不到，而NGS可以检测到低于1％的突变。由此看出，NGS相对于Sanger测序而言，能发现更多低频率的突变。NGS能同时检测多个基因，能更全面地了解肿瘤的分子遗传学特征。对于一个肿瘤个体来讲，其内部存在不同的亚克隆，这些克隆随着疾病的进展及治疗措施的干预会发生动态的变化。研究发现，肿瘤复发时突变的谱型会发生变化，有些是诊断时的主克隆群体产生了新的突变，而这些突变是原来的次要克隆携带的；有的是诊断时的次要克隆演变成主要克隆，此时次要克隆携带的突变变成了频率较高的突变。因此各克隆群体在诊断、治疗后和复发时的变化带来的突变频率的变化在检测结果上就某一项突变而言，可能并无明显差异，但这种没有差异的表现并不能说明肿瘤内部克隆群体没有发生变化。因此，要综合所有的相关突变，以谱型的变化来判断肿瘤的进展、治疗的疗效及疾病的预后，NGS在这方面变出明显的优势［16］。

2.2 NGS在循环肿瘤DNA检测中的应用

1948年Mandel和Metais［17］在人体血液循环中发现游离DNA的存在，称之为“Cell-free DNA”（cfDNA）。随着研究的不断深入，目前研究发现肿瘤患者的外周血中能检测到游离核酸的存在［18］。这些游离核酸以基因组和线粒体DNA成分为主，也被称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）［19］。肿瘤细胞主要通过被动和主动机制2种途径来产生ctDNA。被动机制是肿瘤细胞坏死或者凋亡后，细胞中的DNA释放进入循环系统，游离地存在于血液中［20］。主动机制则是指肿瘤细胞能主动释放DNA到外周循环之中；肿瘤细胞分泌的外排体也可以产生ctDNA。研究发现，在人类很多恶性肿瘤中均能检测到ctDNA如前列腺癌［21］、肺癌［22］、乳腺癌［23］、大肠癌［24］、肝癌［25］、膀胱癌［26］、宫颈癌［27］、胰腺癌［28］、卵巢癌［29］等。肿瘤的原发灶和转移灶之间存在遗传学、表观遗传学和转录组学的差异。利用外周血中的ctDNA能更准确、更高效评估肿瘤的进展，如果肿瘤细胞发生某种突变，这些突变可以在ctDNA中反应出来，通过NGS对ctDNA测序获得突变信息，就获得了肿瘤细胞的突变信息。2014年4月在《Nature Medicine》发表的一篇文章指出，将NGS技术应用于血浆ctDNA检测，具有惊人的高特异性和敏感性。作者将此法命名为深度测序肿瘤个体化建档法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）［30］。研究者对不同级别的肺癌患者进行了CAPP-Seq验证，发现对II～IV期的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）检测敏感性达100％，I期的NSCLC中敏感性为50％；对各期肺癌的特异性均为96％。以上结果显示CAPP-Seq并不比金标准肿瘤活检的诊断效能差，能够准确测定肺癌的基因型。

研究发现，外周血中出现高频的肿瘤相关基因突变如p53、KRAS和APC等，往往与较高的临床分期有关，也预示着患者较差的预后；与肿瘤靶向治疗、诊断及预后相关标记如K-ras、BRAF、HER-2、p53、EGFR、APC等，通过NGS技术对ctDNA中这些的标记物进行测序，能够更精确更全面地为肿瘤的靶向治疗、药效检测和患者的预后评估提供依据［31-32］。

2.3 NGS在肿瘤风险预测及预防中的应用

NGS技术可使肿瘤防治措施前移至预防阶段。大量研究表明某些肿瘤的发生与个别关键基因突变有密切关系。乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）变异被发现与女性的遗传性乳腺癌和卵巢癌相关［33-34］。BRCA1/2基因是一类肿瘤抑制基因，可以帮助修复DNA损伤并能确保细胞的遗传物质（DNA）的稳定性，防止细胞生长变异。但当BRCA1/2基因发生变异后，细胞失去了这一保护作用，发生癌变的风险将大大增加，并且还存在家族遗传性。BRCA2基因变异与男性乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌发生同样关系密切［35］。美国好莱坞女星安吉丽娜·朱莉的案例就是一个应用实例。乳腺癌高危人群基因筛选技术以及肺癌基因检测技术已在临床投入使用，国家肿瘤临床医学研究中心开展的乳腺癌基因检测技术，是利用NGS测序技术就BRCA1、BRCA2等6个国际公认的乳腺癌易感基因，进行全外显子基因测序检测，用于预测乳腺癌发生的概率；对于遗传性乳腺癌、卵巢癌和其他癌症，2014版美国国立综合癌症网络指南中明确指出可利用NGS技术检测相关的基因突变。

2.4 NGS在单细胞测序中的应用

2014年，单细胞测序的应用被列为《自然-方法学》（Nature Methods）年度最重要的方法学进展。2015基因组学前沿研讨会将单细胞组学单独列为一个单元。常规的测序样品来源大多数是多细胞的混合DNA，这种方法得到的全基因组序列信息是一群细胞基因信息的平均值，或其中占优势数量的细胞信息，而单个细胞的特性和细胞与细胞之间的异质性则被忽视。单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。但由于PCR扩增时存在偏倚，常导致测序结果的基因组覆盖度很低。2012年，哈佛大学谢晓亮院士在《Science》发表了单细胞全基因组扩增新技术（multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC），即多次退火环状循环扩增技术［36］。不同于以往的非线性或指数型扩增方法，MALBAC技术利用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而很大程度上防止了DNA的指数性扩增，从而解决了基因组扩增对微量初始模板过大的扩增偏倚，使得MALBAC扩增的DNA基因组覆盖度达到93％，并使基因组测序的模板需求量从μg级降至单细胞水平。2012年，华大基因同样利用单细胞测序技术对单个肾癌细胞的单核苷酸突变特征进行分析，从而在更高的分辨能力上为评价基因改变的复杂性提供了更为优化的方法。2014年，华大基因又利用该方法在结肠癌中发现了一个新的癌基因SLC12A5［37］。单细胞测序技术不仅为肿瘤分子分型和个体化治疗提供指导，还将有助于我们理解肿瘤内部的异质性和肿瘤的演进［38］。单细胞测序技术还能与循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）筛选技术相结合，检测外周血CTCs单核苷酸变（single-nucleo-tide variations，SNV）、CNV或外显子组插入/缺失突变，为肿瘤诊断及个体化治疗提供一种非侵入性检测手段。

3 展望

个性化医疗是基于基因序列的分子诊断技术的发展而出现的，目前主要应用的技术是基因测序技术。基因测序技术被应用于个性化医疗，是因为个体化医疗是以每个患者的基因组信息为基础决定治疗方针，了解患者的整体遗传信息，对预防、诊断、治疗和用药提供指导性意见。也因此出现了很多靶向治疗药物，这些药物的用药基础依据患者的基因组及分子差异（变异），所以患者的基因组信息尤为重要，Sanger测序技术，可以用于个体化医疗，但是测序通量小，速度慢，灵敏度较NGS低，成本高，此时需要一种简便、快捷、准确，同时成本又不太高的测序诊断技术就是NGS技术，凭借自身高灵敏度、高通量等特性被广泛用于肿瘤个体化医疗和基因分子生物学的研究并带来新的变化，在肿瘤分子生物学的研究以及临床应用方面，也显示了多方面的影响并推动了个体肿瘤学发展。NGS技术，在临床诊断中应用，对肿瘤患者的疾病诊断和治疗都起到巨大作用。近期提出的精准医疗，它是以个体化医疗为基础，以环境、生活方式、既往病史及诊疗方式等为跟踪对象，搜集全方位、可量化、有前瞻性和时效性的个体数据，通过数据的综合分析、挖掘形成有价值的医学信息，最终设计出针对个体的最优解决方案。在精准诊断方面，对人体了解需要更加深入到基因组、体细胞突变等，这些需要依靠测序技术，通过NGS技术能更精准更全面地了解患者的信息。NGS为个体提供连续基因大数据，是精准医疗的基础和重要实现途径。随着技术的不断革新，测序技术层出不穷。新的测序技术陆续出现，以单分子测序为特点的DNA测序技术已经出现，该测序技术不需要进行PCR扩增，消除了潜在的扩增错误和不均匀，测序长度更长速度更快。最近出现的纳米孔测序技术，相比于前面3类测序技术，该测序技术是真正实现单分子检测和电子传导检测相结合的测序方法，完全摆脱了洗脱和PCR扩增过程。纳米孔测序技术一旦投入市场，将有望在几小时内以几百美元的成本完成全基因组测序。每一项新技术的出现都有超过前代技术的独特之处，但是各代测序均有不足之处，Sanger测序的主要缺陷是低通量和高成本，NGS测序的缺陷是序列长度较短，DNA测序和纳米孔测序在准确率方面尚存在严重缺陷。由于NGS技术面临的短序列缺陷可以通过生物信息学工具在一定程度上进行弥补，因此NGS技术是现今最稳定，应用范围最广泛的测序技术。目前科学家正在通过减缓DNA序列通过纳米孔速度的方式提高新测序的准确度，专家预计10年内新测序的准确度将会显著提升，届时将在保证测序通量的基础上，凭借着超长序列读长的优势将逐步取代NGS测序。随着基因测序通量、准确度的提高和成本的降低，相信测序技术，将在肿瘤分子生物学领域，提高肿瘤的诊断和治疗水平方面发挥重要的作用。

［1］Sanger F，Nicklen S，Coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors［J］.Proc Natl Acad SciUSA，1977，74（12）：5463-5467.

［2］Chu T，Bunce K，HoggeWA，et al.Statistical model for whole genome sequencing and its application to minimally invasive diagnosis of fetal genetic disease［J］.Bioinformatics，2009，25（10）：1244-1250.

［3］王升跃.新一代高通量测序技术及其临床应用前景［J］.广东医学，2010，31（3）：269-272.

［4］赵馨，何天文，尹爱华.第二代测序技术与无创产前诊断［J］.分子诊断与治疗杂志，2014，6（3）：198-203.

［5］Margulies M，Egholm M，Altman WE，et al.Genome sequencing in open microfabricated high-density picoliter reactors［J］.Nature，2005，437（7057）：376-380.

［6］Fedurco M，Romieu A，W illiams S.BTA，a novel reagent for DNA attachmenton glass and efficient of solid-phase amplified DNA colonies［J］.Nucleic Acids Res，2006，34（3）：1818-1822.

［7］Shendure J.Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome［J］.Science，2005，309（5741）：1728-1732.

［8］陈琛，万海波，周清华.新一代基因测序技术及其在肿瘤研究中的应用［J］.中国肺癌杂志，2010，13（2）：154-159.

［9］Droege M，Hill B.The genome sequencer FLX systemlonger readsmore applications，straight forward bioinformatics and more complete data sets［J］.JBiotechnol，2008，136（1-2）：3-10.

［10］Bentley DR，Balasubramanlan S，Swerdlow HP，et al.Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry［J］.Nature，2008，456（7218）：53-59.

［11］Smith DR，Quinlan AR，Peckham HE，et al.Rapid whole-genomemutational profiling using next-generation sequencing technologies［J］.Genome Res，2008，18（10）：1638-1642.

［12］Clark MJ，Homer NO，Connor BD，etal.U87MG decoded：the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line［J］.Plos Genet，2010，6（1）：e1000832.

［13］Gilissen C，Hehir-Kwa JY，Thung DT.Genome sequencing identifies major causes of severe intellectual disability［J］.Nature，2014，511（7509）：344-347.

［14］Schaaf CP，Gonzalez-Garay ML，Xia F.Truncating mutations of MAGEL2 cause Prader-Willi phenotypes and autism［J］.Nature Genetics，2013，45（11）1405-1408.

［15］Ley TJ，Elaine L，Mardis ER，et al.DNA sequencing of a cytogenetically normal acutemyeloid leukaemiagenome［J］.Nature，2008，456（7218）：66-72.

［16］丁晶，宋永平.二代测序在急性髓系白血病中的应用［J］.白血病·淋巴瘤，2013，22（1）：8-10.

［17］Mandel P，Metais P.Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme［J］.CR Acad Sci Paris，1948，142（3/4）：241-243.

［18］Heitzer E，Auer M，Ulz P，et al.Circulating tumor cells and DNA as liquid biopsies［J］.Genome Med，2013，5（8）：73.

［19］杨超，程昌明，杨敏慧，等.外周血循环肿瘤DNA检测方法及应用［J］.分子诊断与治疗杂志，2015，7（1）：60-67.

［20］Schwarzenbach H，Hoon DS，Pantel K.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients［J］.Nat Rev Cancer，2011，11（6）：426-437.

［21］Schwarzenbach H，A lix-Panabieres C，Muller I，etal. Cell-free tumor DNA in blood plasma as amarker for circulating tumor cells in prostate cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，15（3）：1032-1038.

［22］Bidard FC，Fehm T，Ignatiadis M，et al.Clinical application of circulating tumor cells in breast cancer：overview of the current interventional trials［J］.Cancer Metastasis Rev，2013，32（1-2）：179-188.

［23］Friel AM，Corcoran C，Crown J，et al.Relevance of circulating tumor cells，extracellular nucleic acids，and exosomes in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2010，123（3）：613-625.

［24］Lefebure B，Charbonnier F，Di Fiore F，et al.Prognostic value of circulating mutant DNA in unresectable metastatic colorectal cancer［J］.Ann Surg，2010，251（2）：275-280.

［25］Zhou J，Shi YH，Fan J.Circulating cell-free nucleic acids：promising biomarkers of hepatocellular carcinoma［J］.Sem in Oncol，2012，39（4）：440-448.

［26］Bettegowda C，Sausen M，Leary RJ，et al.Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies［J］.Sci Transl Med，2014，6（224）：224.

［27］Javier MG，Sastre-Garau X.Uterine cervix carcinoma：recent biological data and update for improving follow-up and treatment［J］.Isr Med Assoc J，2012，14（11）：700-704.

［28］Kinugasa H，Nouso K，Miyahara K，et al.Detection of K-ras gene mutation by liquid biopsy in patients with pancreatic cancer［J］.Cancer，2015，doi：10.1002/ cncr.29364.［Epub ahead of print］.

［29］Martignetti JA，Camacho-Vanegas O，Priedigkeit N，et al.Personalized ovarian cancer disease surveillance and detection of candidate therapeutic drug target in circulating tumor DNA［J］.Neoplasia，2014，16（1）：97-103.

［30］Newman AM，Bratman SV，To J，etal.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage［J］.Nat Med，2014，20（5）：548-554.

［31］Nygaard AD，Garm Spindler KL，Pallisgaard N，et al.The prognostic value of KRAS mutated plasma DNA in advanced non-small cell lung cancer［J］. Lung Cancer，2013，79（3）：312-317.

［32］Talasaz A，Mortimer S，Sebisanovic D，et al.Use of the GUARDANT360 noninvasive tumor sequencing assay on 300 patients across colorectal，melanoma，lung，breast，and prostate cancers and its clinical utility［J］.JClin Oncol，2014，32（suppl）：e22041.

［33］陈崇，温旺荣.BRCA1基因与乳腺癌的诊断治疗［J］.分子诊断与治疗杂志，2014，6（3）：145-151.

［34］Pilgrim SM，Pain SJ，Tischkowitz MD.Opportunities and challenges of next-generation DNA sequencing for breastunits［J］.Br JSurg，2014，101（8）：889-898.

［35］张蒙，张青云，徐国宾.新一代测序技术在肿瘤临床中的应用［J］.临床检验杂志，2014，32（9）：641-646.

［36］Lu SJ，Zong CZ，Xie XS，et al.Probing meiotic recombination and aneuploidy of single sperm cells by whole genome sequencing using MALBAC［J］.Science，2012，338（6114）：1627-1630.

［37］Yu C，Yu J，Yao X，et al.Discovery of biclonal origin and a novel oncogene SLC12A5 in colon cancer by single-cell sequencing［J］.Cell Res，2014，24（6）：701-712.

［38］van Loo P，Voet T.Single cell analysis of cancer genomes［J］.Curr Opin GenetDev，2014，24：82-91.

Advances in next-generation sequencing（NGS）technology and their application in cancer research

SHAO Xiangyang，XU Weiwen★
（School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Next-generation sequencing（NGS）platforms have recently evolved to provide an accurate and comprehensive means for the research and diagnosis of diseases.Advancements in next generation sequencing technology have provided a new way for the study of the molecular biology of tumors.In this review，the characteristics and developmental trends of next generation sequencing technology are summarized，and applications in tumor research are discussed.

Next-generation sequencing（NGS）；Tumor；Precision medicine

十二五国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA020205）；广州市产学研协同创新重大专项（201508020052）

南方医科大学生物技术学院，广东，广州510515

★通讯作者：徐伟文，E-mail：xu_sandy2006@126.com