非特殊型浸润性乳腺癌HER-2检测方法的对比研究

成玉霞 赫淑倩 董贺 孙青

·论著·

非特殊型浸润性乳腺癌HER-2检测方法的对比研究

成玉霞 赫淑倩 董贺 孙青★

目的应用实时定量PCR技术（quantitive real-time PCR，qPCR）检测石蜡包埋非特殊型浸润性乳腺癌标本的HER-2表达状况，与免疫组织化学技术（immunohistochemistry，IHC）和荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）相应检测结果进行比较，以验证qPCR技术检测HER-2方法的可靠性和实用性。方法采用FISH和qPCR技术对IHC检测结果分别为HER-2（0、1+、2+、3+）的乳腺癌标本各100例进行检测，用kappa检验分析三者的一致性。结果100例HER-2（0）和HER-2（1+）的标本FISH和qPCR的检测结果均无扩增，符合率100％；IHC检测HER-2（2+）的标本，FISH和qPCR检测结果之间k=0.731（P＜0.001），二者一致性强；IHC检测HER-2（3+）的标本，FISH与qPCR检测结果k=0.634（P＜0.001），二者具有较好的一致性，与IHC检测结果也具有较强的一致性。三者对乳腺癌患者的临床病理指标反应具有较好的一致性。结论qPCR方法简便、实用、有效，检测乳腺癌HER-2基因状况可与FISH法互为补充。

非特殊型浸润性乳腺癌；HER-2；IHC；FISH；qPCR

近年来，我国乳腺癌的发病率和死亡率逐年上升，且日趋年轻化，成为威胁女性健康的几大恶性肿瘤之一。据文献报道，约20％～25％的乳腺癌患者呈人类表皮生长因子受体-2（human epidermal grow th factor receptor 2，HER-2）过表达或基因扩增［1］，而HER-2高表达的浸润性乳腺癌分化低，易发生淋巴结转移，且复发早，预后差［2-3］。2002年，美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准赫赛汀用于HER-2过表达的乳腺癌［4］。大量临床研究也表明，HER-2高表达的乳腺癌患者使用赫赛汀治疗后，其无病生存率和总生存期大大延长；相反，HER-2低表达患者使用赫赛汀治疗不能获益。因此标准化检测HER-2受体已成为赫赛汀靶向治疗的重要部分［5］。

目前，美国FDA批准应用于评估HER-2状态的技术为免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）2种。然随着实时定量PCR技术（quantitive real-time PCR，qPCR）的发展和日趋成熟，RNA水平的HER-2检测变得更加简便、快捷，其能否替代FISH技术作为IHC检测的补充，有待进一步的研究确证［6-7］。本研究分别用IHC、FISH和qPCR 3种技术检测400例非特殊性浸润性乳腺癌石蜡组织的HER-2状态，将三者结果进行比较，并对比三者结果与患者临床病理特征之间的联系，以验证qPCR技术的可靠性和实用性及其替代FISH技术的可行性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2010年1月至2014年6月我院手术切除病理明确诊断的非特殊性浸润性乳腺癌患者的石蜡肿瘤组织，重新切片进行IHC检测，由病理诊断医师重新评估，从中选取HER-2免疫组化结果0、1+、2+和3+各100例分别行FISH基因扩增和qPCR检测。患者均为女性，年龄最小为26岁，最大为83岁，中位年龄53.1岁。回顾入组患者ER、PR及Ki-67的免疫组化结果，并统计分析HER-2结果与各指标表达之间的关系。

1.2 IHC法

肿瘤蜡块切片3～4μm，粘附载玻片贴片，常规65℃烘烤过夜，平行加阴阳性对照。使用美国罗氏VENTANA Bench Mark全自动免疫组化染色机和VENTANA抗HER-2蛋白的单克隆抗体，克隆号4b5。IHC标记的操作关键步骤依次为VENTANA脱蜡液EZ 75℃脱蜡4 m in；95℃PH8.0抗原修复30min；缓冲液中漂洗，过氧化物酶阻滞液中孵育4 min；随后加入HER-2一抗，37℃孵育16m in；二抗UV HRP孵育8m in；DAB显色8m in，苏木素复染，返蓝液返蓝，最后漂洗封片。

1.3 FISH法

切片准备同IHC，平行加做阴阳性对照。Path-Vysion HER-2 DNA探针试剂盒购自美国Vysis公司，荧光显微镜型号为德国莱佧LeiCa DM 4000B。操作步骤：充分脱蜡至水，蒸馏水煮沸20 min，晾干后37℃胃酶消化15 m in，漂洗后梯度酒精脱水晾干，加10μL杂交液盖片并用蜡胶封边，85℃变性5 m in，37℃杂交过夜。第2天将切片置于杂交后洗液（2×SSC，0.3％NP-40）中漂浮盖玻片，组织片入杂交后洗液72℃2 m in，再将其放置在暗处室温干燥，滴加10μL DAPI显色液在组织片靶区域，盖玻片封片，荧光显微镜观察结果。使用德国莱佧Leica CW 4000 FISH分析软件进行拍照并计数。

1.4 qPCR法

1.4.1 组织准备

组织进行切片，厚度8～10μm，对照相应组织的HE切片选取肿瘤区域进行显微切割，根据癌细胞量多少使用2～3片进行检测，切片后尽快进行RNA的提取，如不能及时提取要存放于-20℃，以减少RNA的降解。

1.4.2 RNA的提取

提取组织总RNA使用的是微量组织总RNA快速提取试剂盒（江苏默乐生物科技有限公司），采用胍盐裂解的柱式离心法从石蜡组织切片中提取。每例吸取2μL作为模板进行下游实验，剩余可以放入冰箱-20℃保存。

1.4.3 扩增检测

HER-2核酸检测试剂盒（荧光PCR法）购自江苏默乐生物科技有限公司，采用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription ploymerase chain reaction，RT-PCR）结合Taqman荧光探针技术对乳腺癌患者肿瘤组织样本中HER-2基因表达进行鉴别，每个样本同时进行管家基因的检测，实现基因的相对定量，荧光信号的收集定为FAM（HER-2）、HEX（VIC）。同一批次加入阴阳性质控品，仪器为美国ABI公司PCR仪7500。扩增体系为25μL，其中包括RT-PCR buffer 18.1μL，酶m ix 0.4μL，引物探针m ix 4.5μL，RNA（cDNA）模板2.0μL。扩增条件为45℃15 m in；95℃1 m in；然后95℃15 s，58℃1 m in扩增40个循环。

1.5 结果判定标准

HER-2 IHC和FISH检测结果判断标准均为2013年美国临床肿瘤学会/美国病理学家学会2007版乳腺癌HER-2检测指南基础上的更新版本［8］以及我国《乳腺癌HER-2检测指南（2014版）》［9］。

qPCR HER-2检测结果判断标准按照试剂盒说明推荐：阳性质控品ΔCt≥23，且阴性质控品其突变管与参照管均无Ct值，或未出现典型扩增曲线，检测样本的CtHER-2和Ct管家基因都有典型S型扩增曲线，提示本次检测有效，否则无效。ΔCt= 20-（CtHER-2-Ct管家基因），ΔCt≥23，HER-2表达阳性；ΔCt≤21，HER-2表达阴性；21＜ΔCt＜23，应重新检测，若ΔCt＞21，则为HER-2表达阳性，否则为阴性。

对于3种方法差异显著的病例，重复进行检测，确保结果真实可靠。

1.6 统计学方法

应用SPSS 11.5统计学分析软件，3种方法检测结果的一致性采用Kappa检验，P＜0.05为差异具有统计学意义；用χ2和Fisher's Exact test来分析HER-2结果与患者临床病理特征之间的关系。

2 结果

2.1 乳腺癌患者HER-2、ER、PR、Ki-67免疫组织化学染色

乳腺癌肿瘤细胞中ER、PR和Ki-67免疫组织化学染色阳性表达均定位于细胞核，HER-2的表达位于细胞膜（图1）。患者ER表达结果为：阴性80例，15例1+，45例2+，260例3+；PR表达结果为：阴性145例，50例1+，60例2+，145例3+；Ki-67表达结果为：≤5％45例，＞5％且≤30％220例，＞30％且≤50％ 70例，＞50％65例；HER-2结果如表1所示。

表1 浸润性乳腺癌中FISH、qPCR和IHC检测HER-2的结果比较Table 1 Comparison of HER-2 results by FISH，qPCR and IHC

2.2 乳腺癌患者HER-2基因扩增的FISH检测结果

400例标本中，FISH检测结果为：HER-2基因扩增112例，扩增率28％（112/400）；无HER-2基因扩增者285例，占检测总例数的71.3％（291/400）；不能确定者3例，占0.075％（3/400），该3例后经qPCR检测，证实其中2例存在HER-2的扩增，另1例未扩增。肿瘤组织中FISH 3种表达的情况如图2所示。

2.3 乳腺癌患者HER-2基因qPCR检测结果

400例标本中，检测有扩增的115例，扩增率28.8％（115/400），另外285例标本没有扩增，占到检测总例数的71.25％（285/400），见表1。

2.4 乳腺癌患者HER-2基因不同检测方法间的区别与联系

200例IHC检测分别为0/1+的标本中，FISH和qPCR检测无一例扩增，符合率100％；在IHC检测HER-2结果为2+的标本中，FISH的阳性检出率为20％，qPCR的阳性检出率为25％，其中FISH和qPCR结果共同阴性者71例（73％，71/97），FISH和qPCR结果共同阳性者17例（18％，17/97），qPCR阳性而FISH结果阴性的病例6例（6％，6/97），FISH结果阳性而qPCR检测为阴性的有3例（3％，3/97），经Kappa检验，在IHC 2+的乳腺癌中FISH和qPCR的检测结果k=0.731（P＜0.000 1）（表2，图3）。例2例（2％，62/100），FISH结果阳性而qPCR检测为阴性的有4例（4％，4/100），经Kappa检验，在IHC 3+的乳腺癌中FISH和qPCR的检测结果k= 0.634（P＜0.000 1）（表3，图4）。

表2 乳腺癌中HER-2表达2+标本qPCR和FISH表达结果的比较Table 2 Comparison of HER-2 results by qPCR and FISH in IHC（2+）

表3 乳腺癌中HER-2表达3+标本qPCR和FISH表达结果的比较Table 3 Comparison of HER-2 resultsby qPCR and FISH in IHC（3+）

在IHC检测表达为3+的肿瘤组织中，FISH检测的整体阳性率为92％，qPCR的阳性检出率为90％，其中FISH和qPCR结果共同阳性者88例（88％，88/100），FISH和qPCR结果共同阴性者6例（6％，6/100），qPCR阳性而FISH结果阴性的病

2.5 乳腺癌中IHC、qPCR和FISH检测HER-2结果与临床病理特征的联系

病理学分级I级的有40例，Ⅱ级的有295例，Ⅲ级的有65例；淋巴结转移的有175例，无淋巴结转移的有225例；临床分期T1有180例，T2有175例，T3有20例，T4有25例。

IHC和qPCR检测的HER-2结果阳性率均与组织的病理学分级、ER、PR以及Ki67的表达这几个因素密切相关（P＜0.05），而与患者年龄、淋巴结转移情况、临床分期关系不密切，分别见表4、表6；而FISH检测的HER-2结果阳性率与患者的组织的病理学分级、临床分期、ER、PR以及Ki67的表达这几个因素亦密切相关（P＜0.05），而与患者的淋巴结转移情况关系不密切（表5）。

表4 用免疫组织化学（IHC）方法检测的HER-2表达的结果与临床病理特征Table 4 Expression of HER-2 by IHC and clinicopathological parameters

3 讨论

HER-2/neu或HER-2基因定位于人第17号染色体的长臂（17q21.1），其编码的产物HER-2在乳腺癌组织中有25％～30％存在异常高表达［10］。HER-2高表达或其基因的扩增与乳腺癌的发生、发展、预后及治疗等有着重要的联系［11］。HER-2基因扩增的乳腺癌患者对内分泌治疗及常规化疗药物不敏感、预后差，而对HER-2的靶向药物赫赛汀的敏感性较好。2002年，赫赛汀已通过美国FDA认证，但必须在IHC检测HER-2（3+）和/或FISH法检测结果为阳性时才能使用［12］，自此，HER-2检测有了巨大的临床价值［5］。

表5 用荧光原位杂交（FISH）方法检测的HER-2表达的结果与临床病理特征Table 5 Expression of HER-2 by FISH and clinicopathological parameters

表6 用实时定量PCR（qPCR）方法检测的HER-2表达的结果与临床病理特征Table 6 Expression of HER-2 by qPCR and clinicopathological parameters

目前，国内外常用的HER-2检测方法有IHC、FISH、显色原位杂交［13］（chromosome in situ hybridization，CISH）、银染原位杂交（silver in situ hybridization，SISH）和qPCR［14］等，但qPCR尚未作为常规应用。IHC是目前临床上常用的检测乳腺癌HER-2蛋白表达的方法，该方法操作简便、费用低廉、可重复性好。然而由于标记蛋白在组织固定后其抗原活性会下降或消失，从而导致假阴性；抗原修复可提高其敏感性，但修复过度会产生假阳性；另一方面，抗体的差异、结果主观判断差异等原因，均使得IHC结果假阳性或假阴性问题无法避免。全自动免疫组化机的应用，最大程度去除了染色过程中人为因素的影响；但是标本离体时间的长短，之后能否及时有效固定及其标准化的组织处理对于IHC检测结果的准确与否至关重要。FISH是用于检查17号染色体着丝粒和HER-2/neu基因扩增情况的技术，染色体的稳定性比蛋白质好得多，故此技术的敏感性和特异性较高，并可以避免17号染色体的非整倍体现象导致的IHC结果的假阳性，已被公认为检测HER-2基因过表达的金标准。但在进行FISH检测时也会受到一些因素的影响，比如蛋白消化不当、烤片温度过高等，可使荧光信号减弱或无信号；荧光容易淬灭，需要暗视野观察并计数等，使得结果判定容易受人为因素影响；FISH方法试剂成本高，操作繁琐，需要配置特殊的荧光显微镜及专门的软件观察等，无疑给检测带来困难。

qPCR［15］方法是检测RNA的最好选择，更接近于RNA定量，qPCR方法敏感可靠。Chariyalertsak等［16］的研究显示，qPCR方法能简单又精确地检测出石蜡组织中的HER-2表达状况。Barberis等［17］认为qPCR能有效检测HER-2且成本较低，Bossard等［18］也有类似的发现，与IHC相比，qPCR的敏感性和特异性能达到87.5％和100％，与FISH相比，qPCR的敏感性和特异性能达到89.5％和92％。本次实验中我们用实时荧光定量PCR的方法检测HER-2mRNA的表达，研究结果表明无论在HER-2（0，1+）的乳腺癌患者中，还是HER-2（2+，3+）的患者中qPCR检测结果和FISH基因检测结果都出现较高的一致性，（k=0.731，k=0.634，P均＜0.001），由此我们认为qPCR检测结果与金标准FISH的检测结果一致性好，其他研究也得出过类似的结论［19-20］。qPCR方法具有操作简便、经济省时以及可以批量操作的优点，其成本比IHC高，但仅为FISH成本的1/4左右，将来若能应用于临床检测，可为IHC（2+）的患者提供更为经济的选择。

本研究中，IHC、FISH和qPCR检测的HER-2结果阳性率均与组织的病理学分级、ER、PR以及Ki67的表达等因素密切相关（P＜0.05），而与患者年龄、淋巴结转移情况、临床分期关系不密切，说明在反应临床病理特征方面三者具有一致性，从侧面证实了3种检测方法结果的一致性。Zhu等［21］在应用qPCR技术在检测胃癌HER-2也得到了同样的结论。未来qPCR技术有望在乳腺癌HER-2检测中应用于临床与FISH方法互为补充。

本研究中IHC（2+，3+）标本中的阳性率与国内外大多数研究结果一致，但在IHC（0，1+）的标本中未曾检测出阳性，这除了与标本及时充分固定，处理恰当和使用全自动免疫组化染色机染色等因素有关外，还可能与我们使用新的评判标准有关。在我们的研究中应用旧的免疫组化HER-2判读标准有1例判为1+、更新的判读标准为2+的标本，经FISH和qPCR检测示均有HER-2基因扩增，说明更新的判读标准较旧标准避免了漏检，具有更好的参考价值。对于IHC（3+）而FISH（-）或qPCR（-）的患者选择使用赫赛汀靶向药物的疗效尚需进一步大样本的研究和临床随诊验证。

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Com parison of different methods for HER-2 status detection in non-special invasive breast carcinoma

CHENG Yuxia，HEShuqian，DONG He，SUN Qing★
（Department of Pathology，Qianfoshan Hospital，Jinan，Shandong，China，250014）

Objective To compare quantitative polymerase chain reaction（qPCR）with immunohistochemistry（IHC）and fluorescence in situ hybridization（FISH）for the detection of HER-2 in non-special invasive breast carcinoma.Methods HER-2 expression levels in carcinoma tissue were detected using IHC，and the HER-2 gene expression levels were determined by FISH and qPCR.According to IHC results，all patients were divided into 4 groups［（HER-2（0），HER-2（1+），HER-2（2+）and HER-2（3+）］with 100 cases in each. The kappa test was used to measure the consistency among the results of IHC，FISH and qPCR.Results In HER-2（0）and HER-2（1+）groups，there were no differences between the results of qPCR and FISH.In HER-2（3+）group，a few discrepancies were found between qPCR and FISH［k=0.634（P＜0.001）］.In HER-2（2+）group，the diagnostic consistency was good between qPCR and FISH［k=0.731（P＜0.001）］.Using FISH test，there was consistency in correlation between HER-2 expression and clinicopathological parameters in the results of qPCR，FISH and IHC.Conclusion qPCR is a convenient，objective and efficient method，which may be used as an alternative to FISH，for the detection of HER-2 gene state of non-special invasive breastcarcinoma.

Non-special invasive breast carcinoma；HER-2；IHC；FISH；qPCR

国家自然科学基金（81272420）；山东省自然科学基金（ZR2012HM085）

山东省千佛山医院病理科，山东，济南250014

★通讯作者：孙青，E-mail：qingsw99@163.com