云南昆明地区非小细胞肺癌EGFR突变情况研究

苏国苗 杨哲 边莉 潘国庆

·论著·

云南昆明地区非小细胞肺癌EGFR突变情况研究

苏国苗 杨哲 边莉 潘国庆★

目的研究昆明地区非小细胞肺癌（non-small cell lung canncers，NSCLCs）表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变特点及与临床特征（性别、年龄、吸烟、组织学分型）的相关性。方法采用突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）检测昆明地区173例非小细胞肺癌EGFR基因第18～21号外显子基因突变情况，并分析其突变与临床特征的关系。结果173例NSCLCs共检测EGFR突变38.7％（67/173），其中外显子19和21突变分别占突变总数的58.2％（39/67）和25.4％（17/67）；腺癌和腺鳞癌基因突变率分别为44.1％（64/145）和60％（3/ 5）；无吸烟史EGFR突变率51.1％（48/94）显著高于有吸烟史患者24.1％（19/79），P＜0.05；女性EGFR突变率分别为49.4％（44/89）显著高于男性27.4％（23/84），P＜0.05。结论云南昆明地区NSCLCs患者EGFR基因突变主要以19号外显子缺失突变和21号外显子点突变为主，多见于女性、无吸烟史、腺癌和腺鳞癌患者。

非小细胞肺癌；突变扩增阻滞系统；表皮生长因子受体；基因突变

目前，肺癌已经成为我国发病率、死亡率最高的肿瘤，其相关驱动基因研究和个体化治疗也越来越受到临床的关注，而表皮生长因子受体（epidermal grow th factor receptor，EGFR）是酪氨酸激酶家族成员之一，位于细胞膜，当EGFR被配体激活后将引起细胞内该信号通路的级联激活反应，将信号由胞外传递至胞内，调节相关重要基因的表达，进而影响细胞的增殖、迁移、分化以及凋亡［1］。多项基础和临床研究结果均证实，EGFR及其信号通路的关键组分发生异常表达或者体细胞突变，将导致肿瘤细胞的增殖和转移，因此针对EGFR及其信号通路的靶标检测和靶向药物治疗成为肿瘤个体化诊疗的重要研究对象［2］。本次研究检测了云南昆明地区173例NSCLCs患者EGFR基因突变情况，同时对其突变特点及与临床特征关系进行了分析，为临床靶向用药方案的选择提供有力依据。

1 材料与方法

1.1 材料

收集昆明医科大学第一附属医院2014年5月至2016年2月经临床手术切除并经病理确诊的昆明地区非小细胞肺癌标本173例，其中男性84例，女性89例；年龄29～79岁，中位年龄54岁；有吸烟史病人79例。按世界卫生组织肺癌组织学标准分型，腺癌145例、鳞癌20例、腺鳞癌5例及其他3例。所有患者均未接受过放化疗和EGFR-TKI治疗等抗肿瘤治疗。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

肿瘤组织病理石蜡切片：由肺癌亚专科病理医师筛片，调取蜡块，由于标本保存时间过长，DNA会降解（组织固定所使用的10％中性福尔马林中的甲醛与组织DNA大分子之间随着储存时间延长会形成广泛的亚甲基交联桥，导致DNA链的脆性增加，从而更容易发生随机断裂），一般选择储存时间在2年以内的蜡块。用刀片剔除多余蜡块，为防止标本间交叉污染，每切一例标本前用75％酒精擦拭刀片和镊子，切片厚度：6～10μm，数量6～10片，然后用镊子移至干净的1.5 m L离心管中。

1.2.2 DNA提取

将已装有患者组织的离心管置于生物安全柜，使用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA FFEP Tissue Kit（试剂编码：Cat.No.56404）试剂盒并严格按照说明书提取步骤操作，完成后用紫外分光光度计（品牌型号：厦门艾德生物技术有限公司AmonyDx SMA4000）测定DNA浓度。

1.2.3 荧光定量PCR扩增

严格按照人类EGFR突变检测试剂盒（荧光PCR法）（上海源奇生物医药科技有限公司）说明书在生物安全柜中加样，并采用德国ABI公司QPCR仪（型号：Stepone Plus），依据突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）的原理检测EGFR基因外显子18、19、20及21的突变情况。每次实验均设定阴、阳对照及内参照。反应循环参数：42℃，5m in；94℃，3min；94℃，15 s，60℃，60 s，共40个循环。反应体系为25μL。在PCR循环的第一步60℃时收集荧光信号。检测通道为：FAM-TAMRA。参比荧光设定为none。

1.2.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对率的数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验进行分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因突变特点

在173例非小细胞肺癌标本中，共检出EGFR基因突变67例（38.7％）。其中外显子19检测到突变39例（58.2％）；外显子21检测到突变28例（25.4％）；未查见外显子19和外显子21的双突变；外显子18检测到突变3例（4.5％）；外显子20检测到突变2例（2.9％），外显子18和S768I位点双突变3例（4.5％）；外显子21和T790M位点双突变3例（4.5％）。可见云南昆明地区EGFR突变类型主要以19号外显子突变和21号外显子突变为主（表1）。

表1 EGFR基因突变特点（n=67）Table 1 Distribution of EGFR genemutation（n=67）

2.2 EGFR基因突变与临床特征分析

在173例云南昆明地区NSCLCs病例数据统计分析可知：男性患者的EGFR突变率为27.4％（23/84），明显低于女性患者49.4％（44/89）（P= 0.002）；≤60岁患者EGFR突变率为36.2％（38/ 105），＞60岁患者EGFR突变率为42.6％（29/68），两者之间的差异不具有统计学意义（P=0.394）；无吸烟史患者EGFR基因突变率为51.1％（48/94），有吸烟患者为24.1％（19/79），二者比较有统计学意义（P＜0.05）。在145例患者腺癌中64例发生突变（44.1％）与鳞癌及其他组织类型比较有统计学意义（P＜0.05）；在20例鳞癌中均未发生突变；在5例腺鳞癌中3例发生突变（60％）；其它组织类型标本未发现EGFR基因突变（表2）。

表2 EGFR基因突变与临床特征的关系Table 2 Correlation between EGFR genemutation and patient clinical characters

3 讨论

表皮生长因子受体（EGFR）是属于酪氨酸激酶I型受体家族，基因定位于人类第7号染色体的短臂，含有28个外显子，广泛分布于各种上皮细胞的细胞膜上，分为胞外区、跨膜区、胞内区3个部分［3］。EGFR基因突变主要发生在胞内TK区域前4个外显子上（18～21）［4］。位于EGFR酪氨酸激酶活性区域的ATP结合位点，TKI通过与ATP竞争结合EGFR信号通路的传导，最终达到抑制肿瘤的增殖、转移、血管形成等一系列肿瘤细胞生物活动［5］，进而有效的治疗EGFR基因突变的肺癌患者。因此，EGFR突变可以作为NSCLCs患者EGFR-TKI治疗敏感性的预测因子，通过检测EGFR突变的情况可以指导靶向用药及针对性的个体化治疗。

相关研究资料表明，EGFR-TKI的疗效主要与EGFR基因外显子19和21的突变状态有关，且突变多发生于腺癌、非吸烟和女性肺癌患者［6］。本次研究对云南昆明地区173例NSCLCs患者EGFR 18～21外显子突变特点及与临床特征分别进行了分析，结果显示：云南昆明地区EGFR突变类型主要以19号外显子突变和21号外显子突变为主，和目前亚洲人群EGFR检测突变主要以19和21外显子为主的相关文献报道一致［7］；同时检测到外显子外显子18和S768I位点双突变4.5％（3/67）和外显子21和T790M位点双突变4.5％（3/67），可能与我省地域环境、民族和遗传因素等有相关性，有待进一步跟踪研究；EGFR突变在不同性别和病理组织学类型等的病例中差异有统计学意义，女性突变49.4％（44/89）高于男性27.4％（23/84）（P= 0.002）；无吸烟史（48/94）明显高于具有吸烟史患者（19/79）（P＜0.05）；腺癌44.1％（64/145）和腺鳞癌60％（3/5）的突变率高于其它病理组织学类型（P＜0.05）；但EGFR突变与肺癌患者的年龄无明显关系（P=0.394）。综上所述，云南昆明地区EGFR基因突变主要以19号外显子缺失突变和21号外显子点突变为主，多见于女性、无吸烟史、腺癌和腺鳞癌患者。

肺癌细胞中EGFR酪氨酸酶基因编码区外显子19或21突变（体细胞突变）的患者，靶向药物吉非替尼/厄洛替尼的有效率高达80％以上。19号外显子碱基缺失主要发生在746～750位的氨基酸；21外显子点突变表现为858位密码子的亮氨酸转变为精氨酸（L858R）［8-9］。此外还有研究表明EGFR基因外显子18、20和22的突变，也与NSCLCs对EGFR-TKIs的治疗敏感性相关，EGFR基因Exon18突变型患者对药物敏感性增强，药效更佳［10-11］；EGFR基因外显子Exon20（常见于T790M位点）突变型患者对药物耐药性增强，药效差（但其中S768I位点突变目前多考虑对TKI治疗具低敏感性）。EGFR基因22号外显子E884K突变型患者对易瑞沙（吉非替尼）敏感，对特罗凯（厄洛替尼）耐药；但当同时伴有21号外显子L858R突变时，患者对吉非替尼和厄洛替尼敏感性都有增加［12-13］。本研究NSCLCs患者EGFR突变主要发生在19和21号外显子，分别占突变总数的58.2％（39/67）和25.4％（17/67）。

据相关文献报道，中国不同地区EGFR基因突变存在显著的地域差异，台湾地区的EGFR基因的突变主要以外显子21为主［14］，云南和广东地区主要以外显子19为主，而北京、上海地区区域间无明显差异［15］。本次研究得出云南昆明地区EGFR基因突变主要发生在外显子19和21，同时发现3例外显子18与S768I位点罕见双突变，证实了我国NSCLCs患者EGFR基因突变类型存在着地域差异，其可能与民族、遗传背景、环境等有相关性。

综上所述，云南昆明地区NSCLCs的EGFR基因突变与患者的性别、病理组织学类型有关，主要以19号外显子缺失突变和21号外显子点突变为主，多见于女性、无吸烟史、腺癌和腺鳞癌患者，这可为NSCLCs患者个体化诊疗方案的选择提供重要的依据。

［1］Sibilia M，Kroismayr R，Lichtenberger BM，et al. The epidermal grow th factor receptor：from development to tumorigenesis［J］.Differentiation，2007，75（9）：770-787.

［2］唐艳萍，张力图，谭晓玉，等.广西南宁地区非小细胞肺癌EGFR基因突变分析［J］.现代肿瘤学杂志，2014，22（5）：1067-1069.

［3］Han X，Dai GH.Research on EGFR in gastric cancer and its significance［J］.Chin Clin Oncol，2010，15（2）：173-176.

［4］Sharmas V，Bell DW，Setteman J，et al.Epidermal grow th factor receptor mutations in lung cancer［J］. NatRev Cancer，2007，7（3）：169-181.

［5］尹光浩，刘伟，吴勇，等.中国人原发性肺腺癌EGFR基因突变分析［J］.中国老年学杂志，2009，4（290）：443-445.

［6］Lee VH，Tin VP，Choy TS，et al.Association of exon 19 and 21 EGFR mutation patterns with treatment outcome after first-line tyrosine kinase inhibitor in metastatic non-small-cell lung cancer［J］.J Thorac Oncol，2013，8（9）：1148-1155.

［7］Song Y，Yang W.Medical treatment of advanced nonsmall cell lung cancer：progress in 2014［J］.Med J Chin PLA，2015，40（3）：10-15.

［8］董刚强，韩宝惠，黄进肃，等.176例非小细胞肺癌的EGFR基因突变分析［J］.中华肿瘤杂志，2006，28（9）686-692.

［9］王荣，石冬琴，谢华，等.非小细胞肺癌中EGFR基因突变及靶向药物治疗研究进展［J］.中国药理学通报，2013，29（1）：22-26.

［10］Shigematsu H，Gazdar AF.Somatic mutations of epidermal grow th factor receptor signaling pathway in lung cancers［J］.Int JCancer，2006，118（2）：257-262.

［11］Mitsudomi T，Kosaka T，Yatabe Y.Biological and chnical implications of EGFRmutations in lung cancer［J］.JChn Oncol，2006，11（3）：190-198.

［12］Qin BM，Chen X，Zhu JD，etal.Identification of EGFR kinase domain mutations among lung cancer patients in China：implic-Ation for targeted cancer therapy［J］.Cell Res，2005，15（3）：212-217.

［13］Cushman-Vokoun AM，Crow ley AM，Rapp SA，et al.Comparison study of the performance of the QIAGEN EGFR RGQ and EGFR pyroassays for mutation analysis in non-small cell lung cancer［J］.Am JClin Pathol，2013，140（1）：7.

［14］Huang SF，Lju HP，Li LH，et al.High frequency of epidermal grow th factor receptor mutations with complex patterns in non-small cell lung cancers related to gefitinib responsiveness in Taiwan［J］.Clin Cancer Res，2004，10（24）：8195-8203.

［15］陈慧娟，喻长顺，李洪波.广东地区非小细胞肺癌EGFR基因的突变研究［J］.分子诊断与治疗杂志，2011，3（1）：29-32.

Study on mutation of EGFR gene in non-small cell lung cancers in Kunming of Yunnan

SU Guomiao，YANG Zhe，BIAN Li，PAN Guoqing★
（The Department of Pathology of First affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，Yun Nan，China，650032）

Objective This study aimed to investigate gene mutations of epidermal grow th factor receptor（EGFR）and the relation between mutation types and clinical features（gender，age，history of smoking，histology）of NSCLSs in Kunming，Yunnan.Methods Mutations of exons 18，19，20 and 21 of EGFR in 173 NSCLCs from Kunming were detected by PCR-amplification refractory mutation system，and the correlation between mutations and clinical features of NSCLCs were analyzed.Results Mutations were found in 67 cases of 173 lung cancer samples，with an incidence of 38.7％.Mutations were mainly detected in exon 19（58.2％，39/67）and exon 21（25.4％，17/67）.Mutation frequency in adenocarcinoma and adenosquamous cell carcinoma was（41.1％，64/145）and（60％，3/5）respectively.Mutations in non-smoking patients（51.1％，48/94）were higher than those who had a history of smoking（24.1％，19/79）.Mutations in female patients（49.4％，44/ 89）were higher than in males（27.4％，23/84）.Conclusion Mutation frequency of EGFR in lung cancer from patients in Kunming of Yunnan is more frequently detected in female，non-smoking，adenocarcinoma and adenosquamous cell carcinoma and the main types of mutation are exon 19 and exon 21mutations.

Non-small cell lung cancer；Amplification refractory mutation system；Epidermal grow th factor receptor；Gene muation

昆明医科大学第一附属医院病理科，云南，昆明650032

★通讯作者：潘国庆，E-mail：guoqing_pan@163.com