真空冷冻干燥后藻蓝蛋白提取工艺及稳定性的研究

刘玉环，李彩霞，李冬莲

(河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖　734000)



真空冷冻干燥后藻蓝蛋白提取工艺及稳定性的研究

刘玉环，李彩霞，李冬莲

(河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000)

为拓宽极大螺旋藻藻蓝蛋白的应用范围，研究了温度、时间、pH值、固液比对其提取工艺及金属离子、食品添加剂等因素对其稳定性的影响。结果表明：藻蓝蛋白的最佳提取工艺为温度30℃、反应时间1.5h、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液pH值7.0，固液比1∶60，在此条件下藻蓝蛋白的提取率达最大值。藻蓝蛋白在pH值5.0～7.0，温度30℃，室内可见光或暗光条件下较稳定；淀粉、蔗糖、明胶、苯甲酸钠等食品添加剂与低浓度条件下的氧化剂和还原剂对其稳定性影响不显著；金属离子Na+、K+、Mg2+和低浓度的Ca2+、Zn2+、Al3+、Fe3+、Cu2+对其稳定性无影响。因此，藻蓝蛋白在弱酸性环境、低金属离子浓度及常用食品添加剂等条件下较稳定，可将其作为天然色素广泛应用于食品工业中。

极大螺旋藻；藻蓝蛋白；提取工艺；稳定性

螺旋藻具有蛋白含量高、繁殖速度快等特点[1]。螺旋藻中藻胆含量约占藻体干重的10%～25%[2]，主要包括藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白三类[3]。近年来，国内外研究表明，螺旋藻中含有大量蛋白质及各种营养物质，其中活性多糖与藻蓝蛋白具有抗癌、抗氧化、提高免疫力等活性功能，藻蓝蛋白还可作为天然色素或荧光试剂，具有很高的经济价值[4]和广阔的前景[5]。螺旋藻种类主要有极大螺旋藻、钝顶螺旋藻、盐泽螺旋藻等三类，用于保健品生产的螺旋藻主要是极大螺旋藻和钝顶螺旋藻。目前对钝顶螺旋藻的研究较多，但在极大螺旋藻藻蓝蛋白的提取及其稳定性研究方面鲜见报道。因此，本文对极大螺旋藻藻蓝蛋白的提取工艺及其稳定性进行了探讨，旨在为极大螺旋藻藻蓝蛋白的开发和利用提供科学依据。

1　材料、试剂及仪器

材料：极大螺旋藻(Spirulinamaxima)，由甘肃省河西学院凯源微藻中心提供。

试剂：Na2HPO4、 柠檬酸、 NaCl、 MgCl2·6H2O、 KCl、 FeCl3·6H2O、 AlCl3·6H2O、 ZnSO4·7H2O、 CuSO4·5H2O、 CaCl2、淀粉、明胶、蔗糖、苯甲酸钠、抗坏血酸、双氧水等，均为分析纯。

仪器：数显恒温水浴锅HH-4(常州国华电器有限公司)、电子天平、722S 型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、760CRT-双光束紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器厂)、游标卡尺、LGF-30F 冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)。

2　极大螺旋藻藻粉制备

2.1材料准备

取一定量的极大螺旋藻置于4个物料盘中铺平，用游标卡尺测量其厚度为4mm[6]。

2.2真空冷冻干燥

真空冷冻干燥过程分为以下3个阶段[7]：预冷冻阶段—升华干燥阶段—解析干燥阶段；预冷冻(5～6h)达到-50℃ 后打开真空泵进入升华干燥阶段，此阶段耗时较长；当隔板温度达到设定的最高温度40℃时，物料进入解析干燥阶段，并在这一温度下进行干燥至干燥完成；当冷冻箱真空度下降到一定值不再变化后，整个干燥工艺结束。

3　极大螺旋藻藻蓝蛋白提取

3.1藻蓝蛋白最大吸收峰的测定

准确称取0.5g极大螺旋藻藻粉，以1∶60的固液比溶于pH值7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液中，30℃水浴恒温提取1.5h，离心(2 000r/min，10min)后取上清液于波长280～700nm 范围内测其吸光值，并确定藻蓝蛋白的最大吸收峰[8]。

3.2单因素对藻蓝蛋白提取率的影响

固定其他条件，按步骤3.1处理后，在波长为618nm处分别考察pH值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)、提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)、提取温度(30、40、50、60、70、80、90℃)、固液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)对藻蓝蛋白提取率的影响。

3.3正交试验设计

在单因素试验的基础上，选用L9(34)正交试验设计，以pH值、提取时间、提取温度和固液比为考察因素，以提取液的吸光值为考察指标，研究各因素对藻蓝蛋白提取率的影响，从而确定最佳提取工艺条件(表1)。

表1　正交试验因素与水平

4　极大螺旋藻藻蓝蛋白稳定性试验

4.1藻蓝蛋白提取

藻蓝蛋白提取步骤同3.1。

4.2不同因素对藻蓝蛋白稳定性的影响

4.2.1pH值准确移取1mL提取液7份于已编号的试管中，用不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的缓冲溶液定容至10mL，混合均匀后于暗光下静置，每隔12h测其OD618[9]。比较不同pH值对藻蓝蛋白稳定性的影响。

4.2.2温度依据3.2所得结果，准确移取1mL提取液3份于已编号的试管中，分别用不同pH值(5.0、6.0、7.0)的缓冲溶液定容至10mL，混合均匀后于不同温度(20、30、40、50、60、70、80、90℃)下水浴保温，每隔30min测其OD618[10]。比较不同温度对藻蓝蛋白稳定性的影响。

4.2.3光照准确移取1mL提取液于已编号的试管中，分别用不同pH值(5.0、6.0、7.0)的缓冲溶液定容至10mL，混合均匀后于光照、室内可见光、室内避光条件下贮存，每隔30min测其OD618[11]。比较不同光照条件对藻蓝蛋白稳定性的影响。

4.2.4食品添加剂准确移取1mL提取液于已编号的试管中，分别用不同浓度梯度(W/V)的淀粉、明胶、蔗糖、苯甲酸钠、抗坏血酸、双氧水溶液稀释至10mL[12]，混合均匀后于室温下静置，经10 h后测其OD618[13]。比较不同食品添加剂对藻蓝蛋白稳定性的影响。

4.2.5金属离子分别配制浓度为0.1mol/L 的NaCl、 MgCl2·6H2O、 KCl、 FeCl3·6H2O、 AlCl3·6H2O、 ZnSO4·7H2O、 CuSO4·5H2O、 CaCl2母液25mL[14]，再分别移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL母液稀释至10mL，试验过程同4.2.4。比较不同金属离子对藻蓝蛋白稳定性的影响。

4.2.6统计分析每个样品重复测定3次，结果取平均值。用Microsoft Office 2003 的Excel软件对数据进行简单处理，用Originpro8.5软件作图。

5　结果与分析

5.1极大螺旋藻藻蓝蛋白可见吸收光谱

由图1可知，极大螺旋藻藻蓝蛋白在紫外-可见光范围内的最大吸收光谱为618nm[15]，该结果与张昆等从螺旋藻中提取天然食用色素的研究结果相一致。

图1　极大螺旋藻藻蓝蛋白紫外可见吸收光谱

5.2各因素对藻蓝蛋白提取效果的影响及分析

5.2.1pH值由图2 可知，当提取液的pH值<4.0时溶液颜色较淡，藻蓝蛋白含量较低；pH值>4.0 时藻蓝蛋白含量随pH值的增大呈显著增加的趋势，且在pH值7.0时达到最大；当pH值继续增大时，藻蓝蛋白的含量显著降低，主要是由于碱性条件下不利于藻蓝蛋白的提取。由上述分析可知，在pH值为7.0时藻蓝蛋白的提取效果最好。

图2　pH对藻蓝蛋白提取效果的影响

5.2.2时间pH值为7.0、固液比为1∶60、温度为30℃的条件下，时间对藻蓝蛋白提取效果的影响如图3所示。从图3中可以看出提取时间在1.5h时，提取液的吸光值较大，说明此时提取液中藻蓝蛋白的含量较多；随着提取时间继续延长，提取液的吸光值呈下降的趋势，说明藻蓝蛋白的提取时间不宜过长，否则会导致色素的降解。因此，藻蓝蛋白的最适提取时间为1.5h。

图3　时间对藻蓝蛋白提取效果的影响

5.2.3温度由图4可知，温度对藻蓝蛋白提取效果的影响较显著。当温度在30～40℃ 时，提取液的吸光值随温度增加呈先增大后减小的趋势；温度在40～60℃ 时，吸光值显著降低；当温度>60℃且继续增加时，吸光值变化不显著，说明藻蓝蛋白在温度>60℃时已变性，不利于提取。综上所述，藻蓝蛋白的最佳提取温度为30℃。

图4　温度对藻蓝蛋白提取效果的影响

5.2.4固液比由图5可知，pH值为7.0、时间为1.5h、温度为30℃ 的条件下，藻蓝蛋白的提取率与固液比呈正相关，当固液比大于1∶50且继续增加时，提取液的吸光值也在增大但变化不显著，因此，将1∶60作为提取藻蓝蛋白的最适固液比。

图5　固液比对藻蓝蛋白提取效果的影响

5.3正交试验

通过表2极差分析可知，各因素对藻蓝蛋白提取效果的影响为D>B>A>C，即：固液比>时间>pH>温度，对藻蓝蛋白提取效果影响最大的因素是固液比。最佳提取条件为：D3B3A2C1，即在温度30℃、pH值7.0、提取时间1.5h、固液比1∶60的条件下，藻蓝蛋白的提取效果最好。

表2　正交试验结果

5.4藻蓝蛋白稳定性试验结果及分析

5.4.1pH值由图6可知，随着静置时间的增加，pH值3.0的管底有沉淀出现，且溶液颜色逐渐变浅，48h时上清液颜色几乎接近无色；12h后pH值4.0的管中呈现胶状，但无沉淀；pH值为5.0～8.0的各管溶液澄清且颜色依次加深，色素残存率为97.28%；pH值5.0 时随着时间的增加溶液的吸光值变化不显著，说明藻蓝蛋白在此pH值下最稳定。由上述分析可知，藻蓝蛋白在pH值5.0～7.0时稳定性最好。

图6　pH藻蓝蛋白的稳定性影响

5.4.2温度温度-pH值双因素对藻蓝蛋白稳定性的影响如图7所示，当温度为25～50℃、pH 值为5.0、6.0、7.0时，溶液的吸光值变化不显著，说明影响藻蓝蛋白稳定性的因素除温度外还与pH值有关；随着温度继续升高，溶液的吸光值呈显著降低的趋势，且溶液的pH值越大，其吸光值变化越显著。因此，藻蓝蛋白在弱酸性[16]、低于50℃的条件下使用时稳定性较好。

图7　温度对藻蓝蛋白稳定性的影响

5.4.3光照光照-pH值双因素对藻蓝蛋白稳定性的影响如图8所示，当pH值为5.0、6.0、7.0时，随着光照时间的延长，溶液颜色在强光下呈极显著下降趋势，150min时pH值为7.0的溶液颜色接近无色，而在室内暗光和低温避光条件下溶液的吸光值变化非常小。因此，极大螺旋藻产品的贮存应是在室内暗光或者低温避光条件下保存，以防有效成分藻蓝蛋白被光破坏。

图8　光对藻蓝蛋白稳定性的影响

5.4.4食品添加剂如图9、10、11所示，明胶、蔗糖、淀粉、苯甲酸钠对藻蓝蛋白稳定性的影响不显著。当抗坏血酸的浓度大于0.4%时，溶液会出现乳状，不澄清，并且透明度随浓度的增大而降低。双氧水虽然不会使藻蓝蛋白溶液出现浑浊，但经过10h后藻蓝蛋白含量显著降低。

图9　明胶对藻蓝蛋白的影响

图10　蔗糖对藻蓝蛋白的影响

图11　淀粉、抗坏血酸、苯甲酸钠、双氧水对藻蓝蛋白的影响

5.4.5金属离子从表3可以看出，Na+、K+、Mg2+对藻蓝蛋白稳定性的影响不显著；Fe3+、Al3+和Zn2+的浓度小于0.002mol/L 时藻蓝蛋白较稳定，当浓度大于0.002mol/L并继续增加时溶液出现乳状或沉淀，Cu2+和Ca2+浓度大于0.004mol/L时溶液出现乳状或沉淀。

表3　5h后各单金属离子对藻蓝蛋白的影响

6　结论与讨论

本文利用光谱分析得出藻蓝蛋白在可见光内波长为618nm处有最大吸收峰值。通过单因素和正交试验得出极大螺旋藻藻蓝蛋白的最佳提取工艺为pH值7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、固液比1∶60、30℃水浴提取1.5h，该工艺简单、操作方便，可用于工业化生产。藻蓝蛋白在pH值5.0～7.0、温度在25～50℃范围内，室内可见光或暗光下较稳定；食品添加剂如淀粉、明胶、蔗糖、苯甲酸钠对藻蓝蛋白稳定性影响不显著，抗坏血酸浓度小于0.4%对藻蓝蛋白稳定性影响较小，双氧水对其影响较大；金属离子如Na+、K+、Mg2+对藻蓝蛋白稳定性的影响不显著，Fe3+、Al3+、Zn2+的浓度小于0.002mol/L 时对藻蓝蛋白稳定性的影响不显著，Cu2+和Ca2+浓度小于0.004mol/L时对其稳定性影响不显著，当浓度超过以上范围时会严重影响藻蓝蛋白的稳定性。

综上所述，本试验通过对极大螺旋藻藻蓝蛋白的提取工艺及其稳定性进行了研究，且首次研究了温度-pH值和光照-pH值双因素对藻蓝蛋白稳定性的影响，旨在为极大螺旋藻在食品工业中的应用提供一定的理论依据。◇

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(责任编辑李燕妮)

Extraction Technology and Stability of Phycocyanin from Spirulina maxima by Vacuum Freeze-drying

LIU Yu-huan，LI Cai-xia，LI Dong-lian

(College of Agriculture and Biology Technology，Hexi University，Zhangye 734000，China)

To broaden the scope of application ofSpirulinamaximaphycocyanin，we studied the influences of temperature，time，pH，solid-liquid ratio on the extraction process and metal ions，food additives and other factors on the stability.The results indicated that the optimum extraction technology of phycocyanin required reaction temperature 30℃，reaction time 1.5 h，Na2HPO4-citric acid buffer pH 7.0，solid-liquid ratio 1∶60，under the optimal reaction conditions，the extraction rate of phycocyanin reached maximum.Under the condition of pH 5.0～7.0，temperature 30℃，indoor visible light or dark，phycocyanin was relatively stable, Starch，sucrose，gelatin，sodium benzoate with other food additives and low concentration of oxidant and reducing agent showed no significant influence on its stability, The metal ions such as Na+,K+,Mg2+and low concentration of Ca2+,Zn2+,Al3+,Fe3+,Cu2+had no effect on the phycocyanin stability.In conclusion，the phycocyanin was relatively stable under the conditions of weak acid environment，low metal ions concentration and common food additives，which could be used as natural pigment widely used in food industry.

Spirulinamaxima；phycocyanin；extraction technology；stability

甘肃省教育厅研究生导师科研项目(项目编号：0909—1)。

刘玉环(1963—)，男，学士，副教授，研究方向：园产品贮藏与加工。