野生蕨菜水提液对秀丽隐杆线虫生理作用的影响研究

刘　静，陈竞适，任海姣，邹婧泽，侯爱香

(1湖南农业大学食品科技学院，长沙　410128； 2湖南农业大学植物保护学院，长沙　410128)



野生蕨菜水提液对秀丽隐杆线虫生理作用的影响研究

刘静1，陈竞适1，任海姣1，邹婧泽2，侯爱香1

(1湖南农业大学食品科技学院，长沙410128；2湖南农业大学植物保护学院，长沙410128)

探索了不同浓度蕨菜水提液对秀丽隐杆线虫整个生命周期生物学功能的影响，对蕨菜水提液的毒理性作出合理评价。实验以秀丽隐杆线虫为模式生物，通过给秀丽隐杆线虫喂食0.1 mL 6种不同浓度(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL)的蕨菜水提取液，观察不同浓度蕨菜水提取液对其生理指标(寿命、产卵数、运动性、细胞凋亡)的影响。研究结果表明：蕨菜能对秀丽隐杆线虫的生理指标产生较大影响，具体表现为随着蕨菜水提取液浓度增加，寿命逐渐缩短，产卵数逐渐减少，细胞凋亡数增加，三者均呈现出明显的浓度依赖性，而对运动性影响不大。

蕨菜；秀丽隐杆线虫；寿命；产卵数；运动性；细胞凋亡

蕨菜为蕨科多年生草本植物，我国主要集中在西北、华北、东北和西南，湖南省的蕨类资源特别丰富。20世纪80年代初，日本科学家在蕨菜中成功分离出“原蕨苷”(ptaquiloside)，并用它来喂动物，发现动物出现骨髓功能丧失、失明等症状，同时在生化实验中发现它还可以与氨基酸反应，也可以破坏DNA。1999年证实蕨菜是唯一能使动物发生自然癌变的高等植物，且蕨菜中的主要致癌物质为原蕨苷[1，2]。很多学者随后开展了蕨菜致癌物的研究。有文献表明，原蕨苷主要集中在蕨菜的新出现产囊丝钩中，原蕨苷最高浓度可达到3.9 mg/g bm，最低为1.98 mg/g bm。随着叶片的不断生长，原蕨苷浓度会慢慢降低，但是尾状核可留住较大浓度的有毒物质[3]。牧场中牛羊食用暴露在地表的蕨菜后，可通过乳汁将毒性传递给人类，这种潜在的风险会给人类带来健康威胁。在此种认识下，很多人对待蕨菜的态度开始转变，从以前的“供不应求”到现在的“谈蕨色变”。但上述国外文献提到的研究调查，要么是直接喂食原蕨苷，要么是整株且长期大量采食。而蕨菜在国内传统的食用方式一般为现采后烹饪或腌制后烹饪，作为时令野菜佐餐采食量十分有限。且国内外有大量对蕨菜功能物质的提取和功能性验证方面的研究，如蕨菜多糖、黄酮类物质在抗氧化等方面的积极作用，如于曙光等[4]对蕨菜粗多糖清除自由基的研究，还有陈乃富[5]对蕨菜中黄酮具有良好的抗氧化活性的研究。因此如何科学采食和加工蕨菜资源成为备受争议的问题。

秀丽隐杆线虫是第一个基因组完全被定序的多细胞真核生物。全部编码基因中线虫基因组约有35%的基因与人基因组同源[6，7]。现已有很多研究以秀丽隐杆线虫为模式生物，研究作用物对其致死率、寿命长短、运动轨迹、产卵数等的影响，并建立了较为完善的毒物毒性评估体系，如李贞景等[8]利用秀丽隐杆线虫的产卵数和致死率指标对4种不同的中药进行毒理性评价。本研究以秀丽隐杆线虫为研究对象，模拟人体摄入蕨菜饮食模型，以新鲜野生蕨菜水提取液为原料，研究在不同浓度蕨菜水提取液作用下秀丽隐杆线虫生理指标的变化情况，从而科学直观地评价蕨菜汁对秀丽隐杆线虫的作用规律，为蕨菜汁开发加工的可行性提供一定的科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料新鲜野生蕨菜水提取液浓度分别为(1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 g/mL)、野生型秀丽隐杆线虫(C.elegansthe Bristol strain N2)以及大肠杆菌OP50(EscherichiacoliOP50)均由东南大学公共卫生学院孔璐教授惠赠。

1.1.2试剂NGM培养基、LB液体培养基、M9缓冲液[9]、吖啶橙溶液(AO)：分析纯，美国Sigma公司试剂。

1.1.3仪器电热恒温培养箱(MJX-250B-Z型，上海博迅实验有限公司)、连续变倍体式显微镜(Motic SMZ-168型，麦克奥迪实业集团有限公司)、单人单面超净工作台(SW-CJ-1FD型，苏州净化仪器厂)、搅拌机(KB50SA型，佛山科顺塑料电器实业有限公司)、低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)、生化培养箱(SPX-250BS-Ⅱ，上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2方法

1.2.1新鲜蕨菜水提取液的制备100 g新鲜蕨菜与100 mL蒸馏水按1∶1混合榨汁5 min，汁液用8层纱布过滤，得到的滤液依照上述方法再过滤两次至无明显蕨菜残渣。过滤3次后的滤液放入高速离心机中以5 000 r/min快速离心20 min，除去离心杯底滤渣得1.0 g/mL的新鲜蕨菜汁。将1.0 g/mL的蕨菜汁进行梯度稀释，配成浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8 g/mL的蕨菜汁，121 ℃高温高压杀菌20 min。

1.2.2E.coliOP50的培养取1支E.coliOP50冻存管在37 ℃水浴加热下速溶，转入预先杀菌的LB液体培养基，在37 ℃摇床中以120 r/min的速度恒温培养12 h。

1.2.3秀丽隐杆线虫的培养参照Brenner S[10]方法。

1.2.4秀丽隐杆线虫的同期化处理将处于产卵期间的20条秀丽隐杆线虫转移至NGM平板上培养6～8 h后挑出，将有虫卵的NGM平板在22 ℃恒温培养箱中培养72 h后可得到300～400条同期化线虫。

1.2.5秀丽隐杆线虫寿命的测定将同期化后处于L4期的秀丽隐杆线虫转入加有0.1 mL不同浓度蕨菜水提取液和空白实验组(即不含蕨菜汁)的9 cm NGM培养基中，每组实验样本数为30条，每个浓度组包含3个平行组。此时记为寿命0d，此后每天探视线虫，提供相同的培养环境，至线虫死亡，记录线虫正常死亡的条数，除去逃跑和挑飞的线虫条数计算得到其平均寿命。对线虫死亡判断标准为对外部机械性刺激无应答。

1.2.6秀丽隐杆线虫产卵数的测定将同期化后处于L4期的秀丽隐杆线虫分别挑至不同蕨菜水提取液浓度梯度和空白实验组的NGM培养基中，22 ℃给药24 h后挑至新的只含E.coliOP50不含蕨菜原液的 NGM平板中。6个浓度实验组包含3个平行组，每个NGM平板放置1条线虫，放置在22 ℃的恒温培养箱中进行培养，24 h转移1次，直至秀丽隐杆线虫产卵期结束，统计每条秀丽隐杆线虫在产卵期的总产卵数。

1.2.7秀丽隐杆线虫运动性的测定将同期化后的L4期秀丽隐杆线虫分别挑至含有0.1 mL不同蕨菜水提取液浓度梯度和空白实验组的NGM培养基中，每个平板内1条线虫，保证每个浓度均含有3个平行实验组。22 ℃给药24 h后加入放置在显微镜低倍镜头下观察，运动速率是指在1 min内秀丽隐杆线虫的头部摆动次数，弯曲度是指在20 s内秀丽隐杆线虫做一个完整正弦运动的次数。

1.2.8秀丽隐杆线虫细胞凋亡的测定准备6个浓度的NGM平板，每组平板内分别挑有20条经同期化处理的秀丽隐杆线虫，0.1 mL蕨菜汁剂量给药72 h。用当场配制的吖啶橙(75μg/mL)染色。

2　结果与讨论

2.1不同浓度蕨菜水提取液对秀丽隐杆线虫寿命影响分析

由图1可得出，与直接喂食大肠杆菌OP50的空白组相比，涂有蕨菜汁的实验组均对秀丽隐杆线虫的寿命起损害作用，且这种影响呈现明显的浓度依赖性，即随着蕨菜水提取液浓度的不断升高，秀丽隐杆线虫的寿命随之逐渐缩短，对线虫的致死效应增强。出现这种结果，可能是线虫作为最简单神经系统的生物之一，一定浓度的蕨菜提取液能够对线虫的神经系统造成较大的损害，神经系统是指导其正常的生理代谢的重要结构，神经系统的损害使正常代谢失去控制，造成代谢紊乱，缩短线虫的寿命。在1.0 g/mL蕨菜汁培养下的秀丽隐杆线虫寿命时间降低率为25.91%，说明高浓度的蕨菜水提取液具有较强的致死效应。

图1　不同浓度蕨菜水提取液对秀丽隐杆线虫寿命的影响　　注：组分间用不同字母表示差异性显著(P<0.05)；组分之间有1个字母相同则表示差异性不显著，下同。

2.2不同浓度蕨菜水提取液对秀丽隐杆线虫产卵数的影响分析

由图2可看出，在不同浓度蕨菜水提取液喂养下，秀丽隐杆线虫产卵数均低于空白实验组，说明秀丽隐杆线虫的生殖能力受一定浓度的蕨菜水提取液影响，随着蕨菜水提取液浓度的增加，该种损伤影响逐步增强。秀丽隐杆线虫体内染色体对数较少，有5对常染色体和1对性染色体，染色体数目相对较少，在一定蕨菜提取液的作用下能够对性染色体造成较大的伤害，可能导致部分生殖功能受损。且易得出在1.0 g/mL的最高给药浓度下，对生殖能力的损害作用最强。

图2　不同浓度蕨菜水提取液对秀丽隐杆线虫产卵数的影响结果

2.3不同浓度蕨菜水提取液对秀丽隐杆线虫运动性的影响分析

由图3、4可以看出，虽然弯曲度和运动速率有些起伏，但整体在均值上下浮动，可认为蕨菜汁对秀丽隐杆线虫的运动性没有显著影响，没有浓度依赖性的规律特征出现。可以认为线虫通过消化道摄入蕨菜提取液，而线虫的运动主要是通过表皮收缩实现，因此并未对线虫的运动功能产生影响。

图3　为不同浓度蕨菜水提取液液对秀丽隐杆线虫运动速率的影响结果

图4　为不同浓度蕨菜水提取液液对秀丽隐杆线虫弯曲度的影响结果

2.4不同浓度蕨菜水提取液对秀丽隐杆线虫细胞凋亡的影响分析

由于DNA断裂而增加的凋亡细胞经吖啶橙染色处理后呈现黄色或橙色，正常细胞呈绿色，在荧光倒置显微镜下可观察到明显的绿色正常细胞[11]。由图5 a-f可观察出图a绿光最强，随着蕨菜水提取液浓度的不断升高，绿光强度越来越弱，即秀丽隐杆线虫体内正常细胞越来越少，说明可能蕨菜提取液中存在某些促使线虫DNA断裂的毒性物质，通过影响控制细胞凋亡的基因，来增加凋亡细胞数，从而缩短线虫的寿命。与空白组对比，喂养蕨菜水提取液的线虫绿光明显较弱，凋亡细胞越来越多，呈现明显的浓度依赖性。在1.0 g/mL浓度下，绿光强度最弱，蕨菜水提取液对秀丽隐杆线虫的毒害作用达到最强。

0.0 g/mL

0.2 g/mL

0.4 g/mL

0.6 g/mL

0.8 g/mL

1.0 g/mL

3　讨论与分析

3.1蕨菜水提液对秀丽隐杆线虫寿命、产卵数和运动性的影响

国内已有多位学者对蕨菜进行了深加工、功能性成分的提取和验证等方面的实验。许文涛等[12]通过调整不同的料水比、提取温度和提取时间，结合响应曲面法得出了蕨菜多糖的优化提取参数，黄建韶等通过研究不同pH、温度、底物浓度、抑制剂条件下对蕨菜中多酚氧化酶作用的影响来抑制蕨菜的褐变[13]。国外也有研究证明牛的上消化道的鳞状细胞癌与蕨菜的慢性毒性有关[14]。

本研究所使用的蕨菜水提液为多物质混合物，即整株蕨菜榨汁去渣水提所得，从研究看来，在低浓度范围下，蕨菜汁对秀丽隐杆线虫的影响不大，如在0.2 g/mL浓度下，运动性几乎无变化，寿命和产卵数的影响也不大。但随着浓度增加，寿命和产卵数均呈现较为明显的下降，在1.0 g/mL的最高浓度下较空白实验组下降百分比分别为25.91%和76.34%。所以采食要注意量的把握，过量会对人体产生较大的损害，但对有毒物质在水溶液中所占的具体百分比还有待下一步研究。在对运动性的研究中，不同浓度蕨菜水提取液并未对秀丽隐杆线虫的运动系统功能产生影响，可能是蕨菜水提取液通过消化道被吸收到线虫体内，并未对线虫运动系统造成损害，从而不能引起其运动能力的降低。但是在对秀丽隐杆线虫寿命和产卵数的研究中，二指标均在高浓度蕨菜水提取液的作用下，较空白组降低幅度较大，说明蕨菜水提取液可以损害秀丽隐杆线虫细胞内的基因结构，对生殖能力的损害更为显著，且毒理性作用呈现较为明显的浓度依赖特征。

3.2蕨菜水提液对秀丽隐杆线虫细胞凋亡的影响

秀丽隐杆线虫体内的细胞凋亡水平随着蕨菜水提取液浓度的增加而提高，喂有1.0 g/mL蕨菜汁的实验组内细胞凋亡水平达到最高。细胞凋亡是主动过程，它是通过激活一系列基因进行表达以及调控，从而争取主动死亡的过程。在高浓度蕨菜水提取液下，细胞主动死亡的过程加强说明蕨菜中的某些物质可能刺激到秀丽隐杆线虫的细胞凋亡基因从而实现大部分细胞程序性死亡的现象。在分子层面上随着蕨菜水提取液浓度增加，细胞凋亡数增多，更好地印证了在个体层面上寿命缩短的情况，由图五的绿色荧光强度即可看出，正常细胞越多，绿色荧光越强，反之则说明体内正常细胞较少。在1.0 g/mL蕨菜水提取液浓度喂养下的秀丽隐杆线虫体内绿色荧光强度达到最低，代表此时线虫体内凋亡细胞数最多。结合个体层面上，秀丽隐杆线虫在不同浓度蕨菜水提取液饲养情况下寿命和产卵数的变化，其作用规律表现出较为显著的浓度依赖性，可以说明蕨菜水提取液能够作用于线虫细胞的凋亡信号通路从而实现促进凋亡、缩短寿命的毒性功能。同时产卵数的减少可能是蕨菜水提取液对秀丽隐杆线虫的生殖腺细胞产生了影响，导致大批量生殖腺细胞开始程序性死亡从而无法进行产卵行为的结果。但本实验对蕨菜中有毒理性作用的物质并未进行深入探究，可以作为未来的研究方向，使蕨菜得到更为合理的利用与发展。

4　结论

本研究模拟人类饮食习惯，将蕨菜加水整株榨汁后，以其水提液喂养秀丽隐杆线虫，试验结果显示，这样处理的蕨菜水提液对秀丽隐杆线虫的生殖系统和细胞凋亡机制都有一定的影响。一方面，对蕨菜仅采取去除根部的加工或食用方法，辅以高温杀菌或高温烹饪也未能有效去除蕨菜的有毒物质，原蕨苷等其他有毒物质不可避免地被摄入；另一方面，对蕨菜采用榨汁水提处理的方式，也并未有效去除原蕨苷等有害物质，说明部分有害物质可能为水溶性的。因此，在后续的研究中，可采取去除根和蕨菜产囊丝钩部分的蕨菜榨汁水提，进一步研究蕨菜的处理方式和毒理特性之间的联系。◇

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(责任编辑李燕妮)

Physiological Effects of Wild Pteridium aquilinum Water Extract on Caenorhabditis elegans

LIU Jing1，CHEN Jing-shi1，REN Hai-jiao1，ZOU Jing-ze2，HOU Ai-xiang1

(1College of Food Science and Technology，Hunan Agricutural University，Changsha 410128，China；2College of Plant Protection，Hunan Agricutural University，Changsha 410128，China)

To investigate the effect of different concentrations ofPteridiumaqulinumionCaenorhabditiselegansin the whole life，macle a proper comment on the toxic properties of it.This experiment selectedCaenorhabditiselegansas a model organism in order to find the impact of different concentrations ofPteridiumaqulinumion the physiological(life-span，eggs laying，motility，apoptosis)signs ofCaenorhabditiselegansby feeding the volume of 0.1 mL from six kinds of concentrations which were 0.0，0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 g/mL respectively.The results showed thatPteridiumaqulinumiexactly had the capability of affecting the index of physiological.With the rising concentration，mean life-span decreased，reproductive output decreased and apoptosis increased were observed，all the changes appeared in concentration-dependent，but there came to be ineffective about its apoptosis.

Pteridiumaqulinumi；Caenorhabditiselegans；life-span；eggs laying；motility；apoptosis

湖南农业大学2015年大学生创新性实验项目(项目编号：XCX1519)。

刘静(1996—)，女，在读本科，研究方向：食品微生物技术。

侯爱香(1982—)，女，讲师，研究方向：食品微生物技术。