基于不同酸碱值与培养养分差异的螺旋藻扩殖生产优化研究

方鑫源 ，郑皓远 ，2，3

（1.三明学院海峡理工学院，福建 三明 365004；2.三明学院资源与化工学院，福建 三明 365004；3.药用植物开发利用福建省高校工程研究中心，福建 三明 365004）

螺旋藻是微藻之一，同时也是第三代生质能源发展所使用的主要藻种。螺旋藻是一种低等的多细胞生物，无成形细胞核，属原核生物，因其外观排列成螺旋状而得名螺旋藻，是由法国科学家克里门特博士于20 世纪60 年代在非洲探险时所发现[1]。螺旋藻易于培养且生长繁殖非常迅速。其生长繁殖方式主要以营养繁殖为主，工业培养时，一般在低浓度条件下，给予其适宜生长环境，经历3～5 d 的时间，其数量就能增长约一倍[2]。螺旋藻既能进行光合作用，又是很多底层动物重要的食物来源，而且它还能提供一些具有抗氧化作用的色素蛋白[3]。例如虾红素（也叫虾青素）是最强的天然抗氧化剂之一，抗氧化性极强，近年来被广泛应用于抗氧化性、抗肿瘤等多种领域[4-5]。但其实虾体内的虾青素是虾通过摄取一些含有虾红素的藻类累积在体内的。有一些虾的虾青素已被证明是与红体相关的主要类胡萝卜素，例如黑虎虾（Penaeus monodon，也叫斑节虾）的颜色[6]。

螺旋藻的藻体包含大量的蛋白质（含量约为55%～70%），是人类至今发现的蛋白质含量最高的生物[7-8]。螺旋藻包含的丰富的蛋白质和色素蛋白是天然的优质蛋白源，长期服用螺旋藻可以提高人体免疫力[9]。早前也有许多商家将其添加到鱼类、禽类饲料中，用以代替蛋白源[10]。

今天，螺旋藻因其具有很多方面的优点，已被广泛应用在很多方面，养殖和加工螺旋藻已经成为一个现代化的大产业[11]。螺旋藻在未来仍具有很大的发展空间，相信螺旋藻凭借着它多方面的优点和科学技术的不断发展会越来越受人们的重视，以后的螺旋藻产品会越来越多样化，出现在我们的日常生活中[12]。

但是现如今在工业的培养上，螺旋藻的生产成本仍旧较高，而许多厂家由于缺乏后续的处理加工过程，其主要的利润都来源于售卖螺旋藻的干粉，导致利润较低[13]。因此，该试验研究的主要目的是为了改善螺旋藻的培养条件，希望通过试验控制法探究不同的影响螺旋藻生长的条件，借此找到能够提高螺旋藻产量、降低螺旋藻生产成本的方法，用以提高培养螺旋藻的经济效益。

1 材料与方法

1.1 化学试剂

HCl；NaOH；NaCl；NaHCO3；MgSO4·6H2O；FeSO4·6H2O；K2SO4；CaCl2·2H2O；NaNO3；K2HPO4；EDTA；H3BO3；ZnSO4·7H2O；MnCl2·4H2O；CoCl2·6H2O；CuSO4·5H2O；Mo7O24（NH4）6·4H2O；

1.2 试验藻种

该试验藻种为钝顶螺旋藻（Spirulina platensis），在分类上属植物界，蓝藻门，蓝藻纲，断殖藻目，颤藻科，螺旋藻属。

1.3 螺旋藻干重检量线制作[14]

分别用吸管吸取高浓度的螺旋藻种藻液10 次，使用分光光度计，在660 nm 处测定，将其分别稀释至 0.1～1.0 吸光度（OD 值），并分别记录其吸光度。用吸管吸取10 种不同吸光值的藻液各30 mL，使用高速离心机，分别于4 500 r/min、离心力24 g下离心20 min，去上清后，加入15 mL 逆渗透水，混匀后，于4 500 r/min、离心力24 g 下继续离心20 min，洗去其他杂质，去上清，于35 ℃的烘干机中烘干24 h，并取出称重。记录数据，并表格与制作检量线，用EXCEL 表格求其OD 值与其干重的关系方程式。

1.4 不同起始pH 值的螺旋藻培养

1.4.1 螺旋藻培养液配置[14]按表1 的成分比例配置螺旋藻营养液，并灭菌备用。

表1 螺旋藻培养液配方

1.4.2 微量元素溶液配置 按表2 的成分比例配置螺旋藻微量元素溶液。

螺旋藻培养液是以营养液与微量元素溶液之比为1 000∶1 的比例配置而成。

1.4.3 灭菌前处理

取6 根容量为150 mL 的光反应器，与配置完成的螺旋藻培养液一起置于高温高压灭菌锅中（121 ℃，0.12 MPa）灭菌 20 min。

表2 微量元素溶液配置表

1.4.4 藻种配置

吸取50 mL 高浓度的螺旋藻藻种，以冷却后的螺旋藻培养液稀释，用分光光度计在660 nm 波长处测量，调整螺旋藻液初始的OD 值约为0.15。

1.4.5 pH 值调整[15]

取600 mL 配置好的螺旋藻液平均分为6 份，分别倒入6 根光反应器中，使用水质检测仪检测其pH 值，用滴管缓慢滴加NaOH 溶液与盐酸溶液，分别调整6 根光反应器中螺旋藻液的pH 值为7、8、9、10、11 和 12。

1.4.6 其他条件设置

用照度计测量，调整整个培养装置的光照强度为3 000 lx，调整空气帮浦空气流速为400 cc/min，对螺旋藻进行24 h 不间断光照培养，每隔24 h 分别取样使用分光光度计在660 nm 波长处测定其OD 值，并记录，制作成OD 值变化表。

1.5 不同起始生质浓度的螺旋藻培养

取2 份300 mL 培养液，加入螺旋藻藻液混匀后使用分光光度计在660 nm 波长处测定其OD 值并分别调整至其OD 值约0.15 和1.50 后，分别放入6 根光反应器中。不调整其pH 值（原始pH 值为9.10）。并保持其他条件与1.4 试验条件一致，并每隔24 h 取样，使用分光光度计在660 nm 的波长处测定其OD 值，并记录，制作成OD 值变化表。螺旋藻培养装置、螺旋藻培养液的配置方法、灭菌前处理步骤皆与前述试验步骤一致。

1.6 不同比例培养基浓度的螺旋藻培养

用1 g/L 的NaCl 溶液，与培养基混合分别调配成培养基含量为1/2 浓度以及3/4 浓度的培养基各300 mL，加入高浓度的藻种，混合均匀后在660 nm处测量其OD 值，调整其OD 值到0.15 左右。各取100 mL 分别放入6 根光反应器中，其他条件与之前对照培养时一致。每隔24 h 取样，用分光光度计在660 nm 的波长下测量并记录其OD 值变化。并与1.4 试验中螺旋藻的起始OD 值为0.15 左右的试验组进行对照，比较其差异。螺旋藻培养装置的设置、螺旋藻培养液的配置方法、灭菌前处理步骤、其他条件的设置皆与1.4 试验步骤一致，不调整其pH 值。

2 结果与讨论

2.1 螺旋藻干重检量线制作

螺旋藻干重称量数据见表3。由图1 螺旋藻干重检量线可知得到的检量线的R 平方值为0.980 5，具有较高的可信度。

藻干重与检量线的关系为每30 mL 藻液的藻干重=0.213×OD-0.021，单位为 g。

每毫升螺旋藻的干重（g）=（OD 值×0.213-0.021）÷30×体积（mL）

表3 螺旋藻干重称量数据

图1 螺旋藻干重检量线图

2.2 不同起始pH 值的螺旋藻培养

如图2 所示，螺旋藻在初始pH 值为12 的情况下，生长的状况非常差，藻液偏黄（螺旋藻大量死亡），只有些许绿色。初始pH 值为7～11 的情况对螺旋藻的生长影响较不明显。刚开始进行培养时，不同pH 值环境的螺旋藻液并没什么明显差异，培养14 d 后，初始 pH 值为 7～11 的 5 个试验组的螺旋藻液颜色外观差异不大，而初始pH 值为12 的试验组的螺旋藻液较其他试验组明显颜色偏淡（螺旋藻密度低）。因螺旋藻培养液的初始pH 值在9.10 左右，相对来说碱性不高，而初始pH 值处于7～11 对螺旋藻的生长影响较不明显。

图2 不同起始pH 值培养后的螺旋藻OD 值变化图

2.3 不同起始生质浓度的螺旋藻培养

图3 所见，指出初始培养OD 值为0.161 的也就是1～3 号光反应器，从开始培养至第12 天，每天的OD 值都有一定程度的增长。而初始培养OD值为1.538 的也就是4～6 号光反应器，在培养的前8 d 内，螺旋藻的浓度有明显的增长，而在培养了8 d之后，螺旋藻的OD 值趋于稳定，没有明显的增长。

图3 不同起始浓度值培养后的螺旋藻平均OD 值变化图

2.4 不同比例的培养基浓度螺旋藻培养

如图4 不同比例的培养基螺旋藻平均OD 值变化图指出，在前6 d 的培养中，1/2 培养基的螺旋藻OD 值增长速度与正常培养基的螺旋藻OD 值增长速度接近，而3/4 培养基的螺旋藻的OD 值增长速度则要比正常培养基的螺旋藻OD 值增长速度要快。在第6 天至第12 天的培养中，1/2 培养基的螺旋藻OD 值增长速度已经开始明显慢于其他两组，而3/4 培养基的螺旋藻OD 值增长速度与正常培养基的螺旋藻OD 值增长速度非常接近。在培养了12 d 之后，3/4 培养基的螺旋藻液OD 值基本已不再有持续的增长，保持相对稳定在2.8 左右，到培养的第17 天时，藻的OD 值仍然只有2.85，而正常培养基的螺旋藻OD 值仍在持续增长，并在培养的第17 天增长到了3.955。

从试验结果我们可以知道，3/4 比例的培养基虽然最终的螺旋藻OD 值只能达到2.8 左右，比不上正常的培养基，但其完全可以在前12 d 的螺旋藻培养中替代正常培养基使用（工业培养的螺旋藻一般在螺旋藻生长对数期的低OD 值阶段收获，此时螺旋藻的生长速度最快最有经济效益），这种将盐水与培养基以1∶3 的比例混合而成作为螺旋藻培养基的做法若是可以实行，那在工业的培养上可以节省约1/4 的培养基原料成本，这对降低螺旋藻工业培养的成本有很大的利用价值。而1/2 比例的培养基虽然在前6 d 的OD 值增长与正常培养基的OD 值增长速率近似，但其在第六天之后OD 值的增长速率太慢，且其最后的OD 值也比另外两组要低不少，在工业的培养上可以说是没有太大的利用价值。

图4 不同比例的培养基螺旋藻平均OD 值变化图

3 结论

研究前期，先对螺旋藻分别在初始pH 值为7～12 的不同环境下进行光照强度为3 000 Lux、24 h光照培养研究，培养时间为14 d。研究结果发现除初始pH 值为12 的高碱性环境不适合用在螺旋藻的培养，其他7～11 的pH 值对螺旋藻的生长无较大影响。故不再继续进行关于初始pH 值的的探讨。后续研究，进行初始生质浓度不同的螺旋藻培养，最终螺旋藻藻液的OD 值相差不大，这也表明正常培养时，培养液存在营养过剩的状况，有望通过稀释培养基的比例来降低其培养成本。第三阶段研究使用1/2、3/4 两种不同浓度比例的培养基进行螺旋藻培养，并与第二阶段研究中的正常培养基的培养结果进行对比。结果表明，3/4 比例的培养基可以替代正常培养基进行螺旋藻的前期培养，以此来降低培养成本。但到了培养后期3/4 比例培养基螺旋藻的生长速度及最高生质浓度均不如正常培养基。而1/2 比例的培养基虽然在前6 d 的培养中不会比正常的培养基差，但在后续的培养中其螺旋藻的生长速率及最高生质浓度明显低于另外两组，所以利用价值较低。

4 致谢

感谢“福建省中青年教师教育科研项目（JT180493）”以及“福建省科技特派员（明财（教）指（2018）135号）”等项目资助完成研究。