张英平,王 霖,刘 蝉,韩玲玲,夏 鹰,张亚中,刘 虎,夏瑞祥
弥漫大B细胞淋巴瘤患者呼气中挥发性有机物的筛查
张英平1,王 霖1,刘 蝉2,韩玲玲2,夏 鹰3,张亚中2,刘 虎4,夏瑞祥1
目的 筛查弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者呼气中的特异性挥发性有机物(VOCs),为呼气检测在DLBCL诊断中的应用提供实验依据。方法 收集32例DLBCL患者呼气样品,30例健康者呼气样品作为对照。利用固相微萃取-气相色谱/质谱(SPME-GC/MS)检测两组呼气样品中的VOCs,应用秩和检验筛选出DLBCL患者特征性VOCs。结果 DLBCL患者呼气样品中可检测到11种特征性VOCs,分别为3-己酮、丁烷、壬醛、环己醇、苯、环己烷、己烷、癸烷、4-庚酮、十二烷、十六烷,其中烷烃类、酮类、苯类有机物较对照组明显增高,醛类、醇类明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。在Ⅰ~Ⅱ期与Ⅲ~Ⅳ期DLBCL患者呼气中,表达无显著差异。结论 3-己酮、丁烷、壬醛、环己醇、苯、环己烷、己烷、癸烷、4-庚酮、十二烷、十六烷可能作为DLBCL患者特异性VOCs,但这些标志物与DLBCL患者的临床分期无关联。SPME-GC/MS检测方法可应用于DLBCL患者的辅助筛查。
弥漫大B细胞淋巴瘤;呼气;挥发性有机物;气相色谱/质谱
弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)中最常见的一种类型,在中国DLBCL占所有NHL的45.8%,占所有淋巴瘤的40.1%[1]。目前DLBCL的诊断主要依靠病理,其有创,检查时程长、花费大,患者依从性差。因此,急需建立一种无创、快捷方便、相对廉价的检查方法,作为一项常规体检项目来初步筛查患者是否患有淋巴瘤。运用呼气分析诊断疾病,主要是通过检测人体呼出气中挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)成份或浓度的改变,来反映相应细胞和组织的代谢情况。研究[2-3]证实VOCs与多种疾病的关系,尤其是肿瘤方面研究较多。该实验采用固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)与气相色谱-质谱(gas chromatography/mass spectrometry,GC/MS)技术联用对DLBCL患者和健康对照者呼气中的VOCs成分进行比较分析,筛查出DLBCL患者呼气中特征性VOCs。
1.1 病例资料 选取2014年11月~2015年4月入住安徽医科大学第一附属医院血液内科的初诊初治DLBCL患者,收集其呼气样品32例,其中男19例,女13例;年龄36~79(57.69±8.74)岁。DLBCL患者均为病理证实,其中Ⅰ/Ⅱ期14例,Ⅲ/Ⅳ期18例。患者近期无感染,无其他肿瘤病史,无胃病、肝病、肾病、糖尿病、甲亢、自身免疫性疾病等。另选择健康对照者30例,其中男18例,女12例;年龄32~68(53.97±8.54)岁。对照组均为经体检证实健康状况良好的患者家属、医护人员等。两组患者性别、年龄差异无统计学意义。所有受试者知情同意。
1.2 主要实验仪器 Tedlar采样袋(4 L)购自大连德霖气体包装有限公司;99.999%氮气购自合肥众仪有限公司;57318型75 μm CAR/PDMS SPME萃取头和手动进样57330U型SPME手柄购自上海安谱科学仪器有限公司;气相色谱/质谱联用仪(GC/ MS-QP 2010 Puls)购自日本Shimadzu公司;HP-5MS毛细管柱(30.0 m×0.25 μm×0.25 mm)购自美国Agilent公司。
1.3 呼气样品采集 受试者前1 d 24:00开始禁食、水,晨起后安静状态下深吸气、屏气数秒后缓慢向Tedlar袋共呼入3 L气体;同时采集周围环境气体作为对照。使用采样袋之前先用99.999%的氮气清洗3次,以除去可能残留的物质。
1.4 萃取、进样及检测方法 每次使用前先将SPME纤维针头加热30 min(在250℃条件下)以除去残留杂质,然后插入呼气标本中,在室温下萃取30 min,随即在GC/MS进样口解析10 min,检测并读取数据。
1.5 气相色谱与质谱条件 气相色谱条件:载气为高纯氦气(He),流速1 ml/min,不分流进样;进样口温度250℃;柱箱程序升温:初温35℃保持5 min,然后以4℃/min升至100℃,最后以20℃/min升至260℃,保持1 min。质谱离子源温度200℃,扫描范围35~350 m/z。
1.6 实验方法重复性和稳定性检测 连续3 d采集相同地点、相同时间段、同一受试者的呼吸气体样品,每份呼气样本重复检测3次,并同时检测周围空气,利用上述SPME-GCMS联用法检测分析。通过对比3例气体样品中VOCs表达的质谱图,显示3份VOCs各主要峰的出峰时间基本一致,且出峰面积也大致相同,说明3者代谢的挥发性有机物成分基本相同,实验的重复性也能达到要求。提示本实验用于检测DLBCL患者呼出气体中的VOCs重复性良好,结果尚稳定。
1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析,采用非参数统计方法中的Wilicoxon秩和检验筛选比较物质。以α=0.05为检验标准。
2.1 呼气中VOCs的分析 按上述步骤1.4、1.5中的实验方法对呼气样品进行检测,选取保留时间为0~32 min的总离子流程图,通过NIST 05数据库检索分析,在DLBCL患者呼气样本中至少检测出98种化合物。DLBCL患者和健康对照者呼气中VOCs色谱图对比见图1,可以看出DLBCL组和对照组在相同保留时间出现的峰高低明显不同,即含量上存在差别,不同峰面积代表不同物质出现的强度不同。经检测分析,结果显示11种有明显差异的VOCs,分别为3-己酮(峰1)、丁烷(峰2)、壬醛(峰3)、环己醇(峰4)、苯(峰5)、环己烷(峰6)、己烷(峰7)、癸烷(峰8)、4-庚酮(峰9)、十二烷(峰10)、十六烷(峰11),其中烷烃类、酮类、苯类化合物较对照组明显增高,醛类、醇类明显减少。见表1。
图1 DLBCL组和对照组呼气样品中VOCs典型色谱图比较
表1 呼气中特征性VOCs峰面积的比较
表2 DLBCL组Ⅰ~Ⅱ期与Ⅲ~Ⅳ期呼气中特征性VOCs峰面积的比较
2.2 不同分期的DLBCL患者呼气中特征性VOCs的表达情况 在Ⅰ~Ⅱ期与Ⅲ~Ⅳ期DLBCL患者呼气中,上述11种标志物的峰面积差异均无统计学意义,即表达含量无明显差异。见表2。
人体主要通过肺泡交换将呼气排出体外,在一定程度上反映了体内的代谢情况。人类呼气成分中这些VOCs质或量的变化与机体的代谢状态有关,通过检测这些变化,可以进一步了解机体的病理生理情况[4]。呼气分析正逐渐成为一种新型的诊断方法,对于患者而言,其是一种无创、相对价廉且可接受性较高的检查。近年,呼气分析已被普遍认为有很大可能成为一种安全快捷的肿瘤诊断替代方法。
呼气成分中内源性VOCs主要由氧化应激产生,为人体的代谢产物[5]。生理情况下,机体里的抗氧化剂可以清除人体内的氧自由基。但是在病理情况下,过多的氧自由基则可以造成生物膜系统损伤以及细胞内氧化磷酸化障碍,其中对DNA的损伤可导致基因突变[6],是一种常见的致癌机制;作用于细胞膜脂肪酸的氧化损伤则会导致机体呼气中VOCs成份或浓度的增多[7]。研究[8]表明多种疾病存在与其相关的特征性VOCs,人体呼气中VOCs的组成与不同疾病相关。氧化路径不同,产生的物质也就不同,但氧化产物大部分属于易挥发的有机物,如烷烃类、醛类、酮类、苯环类及其衍生物等。
呼出气体中与DLBCL相关的VOCs,理论上是由DLBCL细胞代谢产生的,经过血液循环到达肺部,通过气体交换,呼出体外。本研究采用SPMEGC/MS法对DLBCL患者及健康对照者呼气样本中VOCs进行定量分析,结果显示11种特征性VOCs,分别为3-己酮、丁烷、壬醛、环己醇、苯、环己烷、己烷、癸烷、4-庚酮、十二烷、十六烷,其中烷烃类、酮类、苯类化合物较对照组明显增高,醛类、醇类明显减少。一般认为这些VOCs并不仅仅由肿瘤组织所产生,而是肿瘤在发生、发展过程中引起机体相应代谢紊乱而产生的[9]。
烷烃或烷烃的衍生物为人体中挥发性标志物的主要成分,本研究筛选出来的丁烷、环己烷、己烷、癸烷、十二烷、十六烷与其相符,这些物质在血液中溶解度极低,很快经过气-血交换,直接由呼吸系统排出体外。其机制可能为肿瘤细胞中氧自由基活动增强,诱导氧化应激进一步引起细胞脂质过氧化,导致细胞膜中的多不饱和脂肪酸降解增加,故烷烃类物质生成增多。芳香族化合物,如苯也可作用于细胞膜导致脂质过氧化使VOCs产生增多;另外,芳香族化合物被普遍认为与饮酒、吸烟、环境污染和辐射等因素有关,推测其可能与淋巴瘤的病因有一定关系。
3-己酮和4-庚酮属于酮类,通常认为与脂肪酸的过氧化有关,DLBCL患者体内氧化应激增强,进而产生更多的3-己酮和4-庚酮等酮类。花庆龄等[10]运用SPME-GC/MS检测DLBCL患者尿液及健康对照组尿液中VOCs,发现4-庚酮浓度明显升高,本实验结果与之一致。在DLBCL患者呼气中,壬醛的峰面积较对照组低。研究[11]表明,醛类物质的浓度在癌细胞代谢产物中往往低于非癌变细胞。癌细胞消耗醛类物质多与癌细胞中醛脱氢酶活性增高有一定关系。本研究实验组中醇类物质减低,其代谢机制目前尚不明确,推测其产生可能还受到细胞色素P450混合酶系的调控[12],有待进一步研究。
在肿瘤细胞生长过程中,绝大部分肿瘤细胞都存在着氧化应激增强的现象[13]。本研究中,在Ⅰ~Ⅱ期与Ⅲ~Ⅳ期DLBCL患者呼气中,特异性VOCs的表达无显著差异。推测DLBCL患者呼气中VOCs可能与肿瘤的分期无关,呼气分析在DLBCL的早期诊断上可能更具优势。Phillips et al[14]在肺癌检测中,也得到相似的结果。
[1] 李小秋,李甘地,高子芬,等.中国淋巴瘤亚型分布:国内多中心性病例10 002例分析[J].诊断学理论与实践,2012,11(2):111-5.
[2] Peng G,Hakim M,Broza Y Y,et al.Detection of lung,breast,colorectal and prostate cancers from exhaled breath using a single array of nanosensors[J].Br J Cancer,2010,103(4):542-51.
[3] 刘 虎,宋 耕,秦 涛,等.非小细胞肺癌患者呼气中挥发性有机化合物的定量分析[J].中华肿瘤防治杂志,2009,16(23):1857-59.
[4] Schmutzhard J,Rieder J,Deibl M,et al.Piolt study:volatile organic compounds as a diagnostic marker for head and neck tumors[J]. Head Neck,2008,30(6):743-9.
[5] Birben E,Sahiner U M,Sackesen C,et al.Oxidative stress and antioxidant defense[J].World Allergy Organ J,2012,5(1):9-19.
[6] Klaunig J E,Wang Z,Pu X,et al.Oxidative stress and oxidative damage in chemical carcinogenesis[J].Toxicol Appl Pharmacol,2011,254(2):86-99.
[7] Kneepkens C M,Lepage G,Roy C C.The potential of the hydrocarbon breath test as a measure of lipid peroxidation[J].Free Radic Biol Med,1994,17(2):127-60.
[8] Gaspar E M,Lucena A F,Duro da Costa J,et al.Organic metabolites in exhaled human breath-a multivariate approach for identification of biomarkers in lung disorders[J].J Chromatogr A,2009,1216(14):2749-56.
[9] Amann A,Corradi M,Mazzone P,et al.Lung cancer biomarkers in exhaled breath[J].Expert Rev Mol Diagn,2011,11(2):207-17.
[10]花庆龄,王霖,刘蝉,等.弥漫大B细胞淋巴瘤患者尿液中挥发性标志物的筛选[J].安徽医科大学学报,2015,50(4):522 -5.
[11]Brunner C,Szymczak W,Hollriegl V,et al.Discrimination of cancerous and non-cancerous cell lines by headspace-analysis with PTR-MS[J].Anal Bioanal Chem,2010,397(6):2315-24.
[12]Belda-Iniesta C,de Castro Carpeo J,Carrasco J A,et al.New screening method for lung cancer by detecting volatile organic compounds in breath[J].Clin Transl Oncol,2007,9(6):364-8.
[13]Martinez-Outschoorn U E,Balliet R M,Lin Z,et al.Hereditary ovarian cancer and two-compartment tumor metabolism:epithelial loss of BRCA1 induces hydrogen peroxide production,driving oxidative stress and NFκB activation in the tumor stroma[J].Cell Cycle,2012,11(22):4152-66.
[14]Phillips M,Altorki N,Austin J H,et al.Prediction of lung cancer using volatile biomarkers in breath[J].Cancer Biomark,2007,3(2):95-109.
The screening of VOCs in the breath of diffuse large B-cell lymphoma patients
Zhang Yingping1,Wang Lin1,Liu Chan2,et al
(1Dept of Hematology,The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022;
2Anhui Institute for Food and Drug Control,Hefei 230051)
Objective To screen volatile organic compounds(VOCs)in the breath of diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL)patients,and provide the experimental evidence for the diagnosis of DLBCL.Methods Collected the breath samples from 32 patients with DLBCL and 30 healthy people as controls.The VOCs were extracted with solid phase microextraction(SPME)and analyzed with gas chromatography(GC)/mass spectrometry(MS).The Wilcoxon test was used for discriminating the VOCs.Results 11 different kinds of VOCs were detected among the patients with DLBCL breath samples:3-hexanone,butane,nonanal,cyclohexanol,benzene,cyclohexane,hexane,decane,4-heptanone,dodecane and hexadecane.The alkane,ketone,benzene compounds were significantly higher than the controls(P<0.05),the aldehydes,alcohol decreased significantly(P<0.05).There was no difference between the difference markers in the breath of DLBCL patients at stageⅠ~Ⅱ,and stageⅢ~Ⅳ.Conclusion
diffuse large B-cell lymphoma;breath;volatile organic compounds;gas chromatography/mass spectrometry
R 551.2;R 730.4;R 733.4
A
1000-1492(2016)08-1204-04
时间:2016-6-22 14:44:58
http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.060.html
2016-04-19 接收
国家自然科学基金(编号:81472750)
安徽医科大学第一附属医院1血液内科,4肿瘤内科,合肥230022
2安徽省食品药品检验所,合肥 2300513安徽医科大学临床医学院,合肥 230601
张英平,男,硕士研究生;
夏瑞祥,男,博士,教授,主任医师,硕士生导师,责任作者,E-mail:xrx2041@163.com
These substances 3-hexanone,butane,nonanal,cyclohexanol,benzene,cyclohexane,hexane,decane,4-heptanone,dodecane and hexadecane may be used as a characteristic VOCs in patients with DLBCL.There is no association between the VOCs and clinical stages of DLBCL patients.SPME-GC/MS detection method can be used among the DLBCL patients with secondary screening.